siRNA沉默轉酮醇酶樣蛋白1基因對人肝癌HepG2細胞生長微環境的影響

張德太， 左曙榮， 楊 文， 張 科， 宋 斌， 涂啟明

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院檢驗科，湖北武漢430022)

轉酮醇酶樣蛋白1(transketolase-like 1 protein，TKTL1)是轉酮醇酶基因家族中的重要成員，在腫瘤發生發展上起到十分重要的作用。新近的研究表明，在許多惡性腫瘤中TKTL1無論是在mRNA水平還是蛋白質水平表達均顯著上調［1-3］。更有意義的是發現TKTL1表達水平還與腫瘤的臨床分期、侵襲轉移及預后密切相關，TKTL1高表達預示低分化、預后不良并往往伴有轉移［4-5］。如果僅從TKTL1具備轉酮醇酶催化功能尚無法解釋其表達水平與腫瘤轉移的相關性。研究認為，腫瘤細胞生長微環境(包括氧化-還原狀態、環境酸性化、缺氧及細胞外基質變化等)是腫瘤發展的決定因素，它決定了腫瘤是發生轉移還是消失［6-7］。因此，本文通過siRNA沉默TKTL1基因研究其對肝癌細胞HepG2生長微環境的影響，旨在探討TKTL1表達與HepG2細胞轉移潛能的內在聯系。

材料和方法

1 材料

1.1 菌株和細胞 質粒pEGFP-C1-U6(含綠色熒光蛋白基因、耐卡那霉素基因、抗新霉素Rneo基因及人U6啟動子)和大腸桿菌DH5α均購自武漢晶賽公司，人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院細胞庫。

1.2 試劑 T4 DNA ligase、BamH I、Hind III、Sal I和Pst I均為 NEB產品，瓊脂糖膠回收試劑盒為TaKaRa產品，脂質體轉染試劑盒 LipofectamineTM2000購自Invitrogen，MMLV反轉錄酶和Taq聚合酶購自Promega，質粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate，NADPH/NADP+)測定試劑盒為Bioassay產品;D-5-磷酸核糖二鈉鹽、5-磷酸木酮糖、磷酸甘油醛異構酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH)、5’5’-二硫代雙硝基苯甲酸(5’5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid，DTNB)、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)等均購自Sigma;牛血清蛋白標準及其它化學試劑為國產。

1.3 儀器 引物設計軟件為Primer 5.0，電泳儀為北京六一公司產品，可見-紫外分光光度計為Shimadzu產品，超聲粉碎勻漿器由寧波新芝科器研究所生產。

2 方法

2.1 細胞培養 人HepG2細胞用含10%FBS的DMEM培養液，于37℃、5%CO2、濕度飽和的條件下進行培養。每2～3 d傳代1次，傳代時用0.25%胰蛋白酶(含0.1%EDTA)進行消化。

2.2 載體的構建及鑒定 參照文獻［8］，將pEGFPC1-U6質粒和合成靶向TKTL1的siRNA用足量的BamHⅠ和HindⅢ雙酶切消化，低融點瓊脂糖凝膠電泳后回收大片段;將上述2個回收片段在T4連接酶作用下，22℃連接反應過夜;各取2 μL連接產物轉化感受態DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB平皿上，37℃恒溫過夜，從平皿中各挑選3個單克隆菌落于3 mL含卡那霉素抗性的LB培養液中，37℃、270 r/min搖床培養過夜;用質粒純化試劑盒提取質粒，并做PstⅠ和SalⅠ酶切鑒定，構建成功的質粒能被切出1條400 bp大小的DNA帶。最后再挑選鑒定正確的克隆進行DNA測序分析。

2.3 重組質粒轉染HepG2細胞及陽性克隆的篩選應用LipofectamineTM2000脂質體載體介導方法將本室構建好的pEGFP-C1-U6/TKTL1質粒轉染至HepG2細胞［8］。細胞用胰酶消化，計數，取2個6孔板鋪板:1～3孔為轉染pEGFP-C1-U6/TKTL1質粒的HepG2細胞(轉染組)，4～6孔為轉染pEGFP-C1 -U6/UC質粒的細胞(質粒對照組)，7～9孔為未做任何轉染處理的細胞(未轉染組)。轉染48 h后，采用G418進行逐步篩選，篩選8周后獲得穩定克隆。

2.4 轉染細胞mRNA表達的檢測 將穩轉細胞在常規條件下連續培養36 h，收集細胞并以冷PBS清洗后采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，用Oligo(dT)18及M-MLV將其逆轉錄成cDNA。取逆轉錄產物進行PCR擴增，TKTL1的上游引物為5’-TAACACCATGACGCCTACTGC-3’，下游引物為5’-CATCCTAACAAGCTTTCGCTG-3’，擴增條件為94℃45 s，58℃40 s，72℃40 s，擴增產物為150 bp。同時設β-actin為內參照，β-actin的上游引物為5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物為5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，擴增條件為94℃45 s，63℃40 s，72℃ 40 s，擴增產物為186 bp。

2.5 細胞內轉酮醇酶(transketolase，TKT)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)活性的測定 將穩轉細胞在常規條件下連續培養36 h，收集細胞并以冷PBS清洗后在冷裂解緩沖液(50 mmol/L Tris–HCl，150 mmol/ L NaCl，1%Triton X-100，100 mg/L苯甲基磺酰氟，5 mg/L亮抑酶肽，5 mg/L抑肽酶，中0℃裂解30 min，10 000 r/min離心15 min。取上清采用Bradford法進行蛋白定量，參照文獻［9］用速率法測定G-6-PD活性，用Bradford定量法進行蛋白定量，酶活性單位以U/(g protein)表示。參照文獻［10］用動態速率法測定TKT活性，酶活性用每分鐘生成產物的量(ng)與細胞總蛋白(mg)的比值來表示。實驗均重復3次，取3次實驗的平均值。

2.6 細胞內乳酸、GSH及NADPH/NADP+測定 取上述穩轉細胞裂解液的上清液，分別參照試劑說明書用比色法測定乳酸含量及NADPH/NADP+比值，參照文獻［11］測定GSH含量。乳酸及GSH含量均用mmol/g蛋白表示。實驗均重復3次，取3次實驗的平均值。

3 統計學處理

結果

1 siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因后其mRNA表達的變化

siRNA質粒轉染組、質粒對照組和未轉染組的HepG2細胞培養36 h后提取RNA，RT-PCR檢測TKTL1 mRNA表達水平。以未轉染組細胞TKTL1與β-actin mRNA表達之比設為1.0，其它細胞與其對比分析。如圖1所示，siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因后，其mRNA表達下降達60%左右。

Figure 1.Effect of RNA interference on TKTL1 mRNA expression in HepG2 cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.±s.n=3.##P＜0. 01 vs non-transfection.圖1siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因后對對其mRNA表達的影響

2 siRNA沉默TKTL1基因對TKT活性的影響

選擇siRNA質粒轉染組和質粒對照組、未轉染組的HepG2細胞培養36 h后測定細胞內TKT活性。siRNA沉默TKTL1基因后TKT活性與未轉染組和質粒對照組比較有顯著下降(P＜0.01)，質粒對照組與未轉染組TKT活性無明顯變化，見圖2。

Figure 2.Effect of RNA interference on TKT activity in HepG2 cells.Non-transfection:no siRNA plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA: siRNA plasmid transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs non-transfection.圖2 siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因對TKT活力的影響

3 siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因對乳酸生成的影響

siRNA質粒轉染組、質粒對照組和未轉染組的HepG2細胞培養36 h后測定細胞內乳酸生成水平，以未轉染組細胞乳酸水平為內參照。siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因后乳酸生成較未轉染組細胞有顯著下降(P＜0.01)，而質粒對照組與未轉染組無明顯變化，見圖3。

Figure 3.Effect of RNA interference on lactate production in HepG2 cells.Non-transfection:no siRNA plasmid transfection;control:control plasmid transfection; siRNA:siRNA plasmid transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs non-transfection.圖3 siRNA沉默TKTL1基因對乳酸生成的影響

4 siRNA沉默TKTL1基因對細胞內GSH水平的影響

以未轉染組HepG2細胞內GSH水平為內參照，實驗發現siRNA沉默TKTL1基因后胞內GSH水平較未轉染組細胞有顯著下降(P＜0.01)，而質粒對照組與未轉染組無明顯變化，見圖4。

Figure 4.Effect of RNA interference on GSH level in HepG2 cells.Non-transfection:no siRNA plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA: siRNA containing transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs non-transfection.圖4 siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因對細胞內GSH水平的影響

5 siRNA沉默 TKTL1基因對細胞內 NADPH/ NADP+的影響

siRNA沉默TKTL1基因后胞內NADPH/NADP+比值較未轉染組細胞有顯著下降(P＜0.01)，而質粒對照組與未轉染組無明顯變化，見圖5。

6 siRNA沉默TKTL1基因對細胞G－6－PD活性的影響

siRNA將質粒轉染組、質粒對照組和未轉染組的HepG2細胞在常規條件下培養36 h后測定細胞內G-6-PD活性，結果發現3組細胞G-6-PD活性［(158.1±11.1)U/g、(144.1±11.5)U/g和(165.7±13.8)U/g］均無顯著差異(P＞0.05)。

討論

代謝轉變是腫瘤細胞的普遍特點，研究表明，腫瘤細胞主要通過磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)的非氧化階段獲取核酸合成所必需的原料——核糖。TKT就是其中的關鍵限速酶，對腫瘤細胞利用葡萄糖的碳原子合成核苷酸起關鍵性作用［12］。人類基因組中轉酮醇酶基因家族包括TKT基因和2個TKT相似基因，即TKTL1和TKTL2。其中TKTL1定位于Xq28染色體的一個短小片段，該片段包含了許多與腫瘤惡性轉化和細胞周期有關的基因，在腫瘤發生發展上起到十分重要的作用。

Figure 5.Effect of RNA interference on NADPH/NADP+in HepG2 cells.Untransfection:no siRNA plasmid transfection;Control:control plasmid transfection; siRNA:plasmid containing siRNA sequences transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs untransfection.圖5 siRNA沉默HepG2細胞TKTL1基因對細胞內NADPH/NADP+的影響

腫瘤組織TKTL1高表達如何與其轉移特性聯系起來一直是我們感興趣的問題，但如果僅從TKTL1在腫瘤細胞中的催化功能來看尚不能建立TKTL1高表達與腫瘤轉移特性之間的關系。因此，必須從代謝網絡調節的視角來研究TKTL1高表達對其上、下游代謝造成的影響。

本研究發現，腫瘤和微環境之間的相互作用，可以啟動和加快促進腫瘤生長的循環鏈，因此，是腫瘤發展的決定因素。例如Manda等［6］發現腫瘤細胞內氧化-還原狀態的改變與腫瘤組織的臨床分期密切相關。真核細胞抗氧化最主要的機制是谷胱甘肽循環，其結果是保證胞內有足量的GSH，細胞內GSH水平的維持主要依賴于 G-6-PD催化產生的NADPH。研究認為以G-6-PD為限速酶的PPP氧化支路所產生的NADPH對于基質脫附(matrix detachment)的腫瘤細胞存活是必需的，并最終幫助腫瘤細胞發生侵襲和轉移［13］。另一方面，腫瘤細胞糖酵解產生的大量乳酸等酸性物質有利于腫瘤細胞的擴散及拓植新的組織，這些酸性環境既能導致周圍細胞的壞死又能誘導新的腫瘤突變發生［14］。無論是腫瘤細胞內抗氧化能力還是腫瘤周圍環境中的酸性物質均與腫瘤發生轉移密切相關，同時它們均與腫瘤內葡萄糖代謝有關，即TKTL1異常高表達可能會導致這些物質水平的變化，從而產生有利于腫瘤轉移的微環境。因此，本文將以人肝癌細胞(HepG2)為代表通過siRNA沉默TKTL1基因研究其對肝癌細胞乳酸生成及抗氧化能力的改變。

本研究發現，通過siRNA技術沉默HepG2細胞TKTL1基因后，TKTL1 mRNA表達下降60%左右，TKT活性明顯下降，TKT活性的下降同樣造成乳酸生成減少、細胞內GSH及NADPH/NADP+比值顯著降低。有意義的是，本文還發現通過siRNA技術沉默HepG2細胞TKTL1基因后細胞內抗氧化能力下降但G-6-PD活性并無明顯變化，這與我們前期通過下調G-6-PD表達的研究結果不一致［11］。因此，我們推測本研究中肝癌細胞內GSH及NADPH/ NADP+比值顯著降低可能并不是由于NADPH生成減少，而是細胞內代謝產生的活性氧簇(ROS)增多造成的。即下調腫瘤細胞TKTL1表達后不僅改變PPP中的非氧化階段代謝，同時可能影響到有氧糖酵解或(和)葡萄糖在線粒體內的氧化磷酸化代謝。腫瘤細胞內過表達的TKTL1能通過調整葡萄糖的代謝，改善氧化-還原平衡狀況、增加糖酵解并生成乳酸，從而改變腫瘤生長的微環境，導致其朝著有利于腫瘤細胞轉移的方向轉變。至于在葡萄糖的代謝調節網絡中TKTL1是如何影響及通過什么機制影響葡萄糖代謝通路將是下一步需要研究的內容。

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