STAT1和ICAM－1在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義*

張 潔， 陳俊杰， 陳成水， 王夢怡

(溫州醫學院附屬第一醫院呼吸內科，浙江溫州325000)

肺癌的發病率和死亡率均居世界惡性腫瘤的首位，嚴重危害著人類的健康。在我國，肺癌已超過死因的20%，肺癌每年大約有40萬例患者死亡［1］。目前在臨床上，雖然有不少腫瘤標志物已經在應用，像鱗狀細胞癌抗原、癌胚抗原、細胞角蛋白19和神經元特異性烯醇化酶，但是肺癌的發病率及死亡率每年仍呈持續增長。研究表明，腫瘤的發生是多基因、多因素導致細胞增殖和死亡異常的結果［2］。目前，有研究發現信號轉導與轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)和細胞間黏附分子 －1(intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)與惡性腫瘤的發生關系密切，但它們與非小細胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)關系的報道較少。本研究應用 real－time PCR和Western blotting方法對NSCLC組織中的STAT1和ICAM－1進行檢測，擬探討它們在肺癌組織中的表達情況與腫瘤病理、不同分期、有無轉移的相互關系，了解其在肺癌發展和轉移中的作用，為肺癌的及早診斷和治療提供線索和依據。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 選取2010年6月至2011年6月期間于溫州醫學院附屬第一醫院行外科手術切除的肺癌患者，術后皆得到病理證實的NSCLC標本40例;取離腫瘤組織5 cm以上的肺組織作為正常對照40例。男性29例，女性11例，年齡36～79歲，平均年齡56.2歲，病理圖片見圖1。依據WHO肺癌的分類方法進行組織學分類，其中鱗癌13例，腺癌27例(其中包括2例肺泡細胞癌)，依照腫瘤分級標準(依據組織結構、異型性、核分裂象等)分為高－中分化組及低分化組，高－中分化24例，低分化16例。按國際抗癌聯盟(UICC)2009年肺癌分期分為I期、II期、III期和IV期，由于本研究病例數有限，將I期和II期歸為臨床早期，III期和IV期歸為臨床晚期，早期肺癌29例，晚期肺癌11例。出現淋巴結轉移的有12例，無轉移的有28例。

1.2 試劑 Real－time PCR試劑盒(Fermentas); SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX(Bio－Rad);TRIzol裂解液(Invitrogen);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo);預染蛋白質marker和膜封閉液(Thermo)。哺乳動物細胞蛋白提取試劑盒(Fermentas);PVDF膜(聯科生物公司，中國);鼠抗人STAT1單抗和兔抗人ICAM－1單抗(BD);鼠抗人β－actin單抗、HRP標記的山羊抗鼠Ⅱ抗和HRP標記的山羊抗兔Ⅱ抗(聯科生物公司);ECL發光液(Thermo)。

Figure 1.Pathological images of NSCLC and adjacent normal lung tissues(HE staining，×40).A:adenocarcinoma;B:lung tissue adjacent to the adenocarcinoma; C:squamous cell carcinoma;D:lung tissue adjacent to the squamous cell carcinoma.圖1 NSCLC及癌旁肺組織的病理圖片

2 方法

2.1 Real－time PCR方法檢測STAT1和ICAM－1的表達 手術切除后采集的新鮮標本在液氮下保存。用TRIzol裂解液提取總RNA，然后逆轉錄成cDNA，進行實時定量PCR。各引物序列如下:STAT1上游引物5’－TGC ATC ATG GGC TTC ATC AGC－3’，下游引物5’－GAA GTC AGG TTC GCC TCC GTT C－3’;ICAM－1上游引物5’－GGC TGG AGC TGT TTG AGA AC－3’，下游引物5’－ACfT GTG GGG TTC AAC CTC TG－3’;GAPDH上游引物5’－CCA GCC GAG CCA CAT CGC TC－3’，下游引物5’－ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT－3’。所有數值采用2－ΔΔCt法進行相對定量分析。

2.2 Western blotting檢測 將組織標本剪碎，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑，提取組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白樣品經凝膠電泳分離后將蛋白轉印至PVDF膜，含5%脫脂奶粉(BD)的緩沖液室溫封閉2 h后，Ⅰ抗(1∶1 000鼠抗人STAT1單克隆抗體，1∶1 000的β－actin單克隆抗體)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，Ⅱ抗(1∶8 000山羊抗鼠IgG－HRP多克隆抗體)室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗膜，ECL化學發光顯色，X光顯影。重復上述過程，檢測ICAM－1蛋白，Ⅰ抗濃度為1∶1 000，Ⅱ抗濃度為1∶8 000，β－actin同上。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行統計學處理，配對資料采用配對樣本t檢驗，例數不同時，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Real－time PCR檢測STAT1和ICAM－1在組織中的表達

STAT1和ICAM－1在非小細胞肺癌組織中的表達明顯高于非惡性肺組織(癌旁肺組織)，且兩者差異顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 STAT1和ICAM－1在組織中的表達比較Table 1 .The expression of STAT1 and ICAM－1 in lung tissues detected by real－time PCR(±s.n=40)

表1 STAT1和ICAM－1在組織中的表達比較Table 1 .The expression of STAT1 and ICAM－1 in lung tissues detected by real－time PCR(±s.n=40)

*P＜0.05 vs normal lung tissue.

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2 Real－time PCR檢測STAT1表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

STAT1在低分化組織中的表達高于高－中分化組織，且兩者差異顯著(P＜0.05);在臨床分期中，肺癌早期組高于肺癌晚期組，差異顯著(P＜0.05);而在不同病理類型、有無轉移、不同性別、不同年齡組別中，表達無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

3 Real－time PCR檢測ICAM－1表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

ICAM－1的表達在腺癌中比在鱗癌中強，且兩者差異顯著(P＜0.05);在臨床分期中，肺癌晚期組高于肺癌早期組，顯著差異(P＜0.05);表達在有遠處轉移組高于無遠處轉移組，且差異顯著(P＜0.05)。而在不同性別、年齡組別中，表達無顯著差異(P＞0.05)。但在低分化組織中與在高－中分化組織中的表達相比有過度表達的趨勢，但無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

4 Western blotting檢測STAT1和ICAM－1在組織中的表達

STAT1及ICAM－1在非小細胞肺癌組織中的表達明顯高于非惡性肺組織(癌旁肺組織)中的表達，且兩者差異顯著(P＜0.05)，見圖2、3。

討論

腫瘤的侵襲和轉移是十分復雜的生物學現象，是腫瘤細胞與宿主間一系列復雜、多步驟、相互作用的結果［3］。STAT1和ICAM－1分別參與其中。

表2 STAT1和ICAM－1表達與NSCLC臨床病理特征的關系Table 2 .The relationship between the expression of STAT1 and ICAM－1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC detected by real－time PCR(±s)

表2 STAT1和ICAM－1表達與NSCLC臨床病理特征的關系Table 2 .The relationship between the expression of STAT1 and ICAM－1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC detected by real－time PCR(±s)

*P＜0.05 vs squamous cell carcinoma;△P＜0.05 vs well differentiated;#P＜0.05 vs late(stage);▲P＜0.05 vs without (lymph node metastasis).

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STAT是一種DNA結合蛋白，STAT蛋白最重要的功能是參與機體免疫應答和調控細胞增殖與轉化，STATs家族共有 7個成員［4］，其中 STAT1是STAT家族最早被發現的成員，分子量為91 kD，其基因位于小鼠1號染色體上面，相當于人的2號染色體的q12至q33區［5］。STAT1是一類新型細胞內信號轉導和基因表達調控因子家族，與炎癥、腫瘤、免疫性疾病的關系日益受到人們的重視［6］。STAT1具有與P53相近的功能:腫瘤的監視和抑制作用，可被IFN－α、IFN－γ、IL－6、IL－2、表皮生長因子、IL－10等細胞因子激活［7］。研究顯示在多種惡性腫瘤組織和細胞中有STAT表達異常或活性明顯增強，這提示STAT表達異常與惡性腫瘤發生發展有密切關系［8］。在人類多發性骨髓瘤、肺癌和乳腺癌等腫瘤中，均可檢測到STAT1高表達。STAT1是腫瘤抑制子［9］，并主導干擾素信號轉導過程;除為先天性免疫所必需外，也充當生長抑制子和凋亡促動子［10－11］。有臨床研究表明，在肺癌的早期(I～II期)，STAT1表達較高，隨著肺癌的臨床病理進展(III期)，STAT1的表達下降。提示STAT1在早期肺癌患者中的免疫監視和抗腫瘤的作用較強［12］。本研究發現，非小細胞肺癌組織中的STAT1表達明顯高于癌旁肺組織，并且在肺癌早期組高于肺癌晚期組，這提示，STAT1在肺癌組織中持續激活，發揮著腫瘤抑制因子的抗腫瘤作用。而且STAT1在肺癌早期發揮了一定的免疫監視作用，隨著肺癌疾病進展免疫監視功能亦下降，可能是癌細胞通過某種抑制作用，抑制STAT1的表達，從而逃避機體的免疫監視。在本研究中，不同分化程度的肺癌STAT1表達有差異，與分化程度呈負相關趨勢，低分化癌高表達，高分化癌低表達，提示STAT1與肺癌的惡性程度有相關性。

Figure 2.STAT1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.Lane 1，3:normal lung tissue;Lane 2，4:NSCLC.±s.n=40.*P＜0.05 vs normal lung tissue.圖2 STAT1在肺組織中的表達

Figure 3.ICAM－1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.Lane 1，3:normal lung tissue; Lane 2，4:NSCLC.±s.n=40.*P＜0.05 vs normal lung tissue.圖3 ICAM－1在肺組織中的表達

ICAM－1又稱 CD54，屬于免疫球蛋白超家族［13］，是淋巴細胞功能相關抗原 －1(lymphocyte function－associated antigen－1，LFA－1)的配體。研究表明，ICAM－1在多種類型的腫瘤組織中存在異常表達，一定程度上反映了腫瘤的侵襲轉移能力［14］。目前報道較多的有黑色素瘤、腎癌、肝癌、卵巢癌等［15］。ICAM－1分子在腫瘤侵襲、轉移及抗腫瘤免疫中的作用成為近幾年的研究熱點。ICAM－1分布在淋巴管及血管內皮細胞、纖維母細胞、腎上皮細胞等，是參與介導細胞間黏附識別的重要黏附分子［16］，它可與淋巴細胞表面的受體LFA結合，從而使淋巴細胞與內皮細胞穩定黏附。ICAM－1過度活化可促使過多可溶性ICAM－1(sICAM－1)進入血液，競爭性抑制血液循環中ICAM－1/LFA－1依賴的MHC－1類抗原對游離癌細胞的免疫識別作用，從而使癌細胞逃離免疫監視，更容易發生侵襲和轉移［17］。本實驗結果顯示，肺癌組織ICAM－1明顯高于非惡性肺組織。提示肺癌組織表達ICAM－1是機體抗腫瘤免疫功能提高的表現，ICAM－1通過與相應LFA－1、Mac－1結合使更多的免疫效應細胞聚集，發揮機體免疫系統的抗腫瘤作用，使機體的免疫監視能力增強［18］。在臨床分期中，肺癌晚期組高于肺癌早期組，ICAM－1的表達上調可能與肺癌細胞的TNM分期有密切關系，說明隨著疾病的加重，ICAM－1水平也伴隨升高，促進細胞的惡性增殖，導致癌細胞侵襲轉移，這可作為評估非小細胞肺癌是否進展的指標之一。腺癌的ICAM－1表達高于鱗癌，這與腺癌比鱗癌易于侵襲和轉移的臨床特點基本符合。同時有淋巴結轉移的肺癌病人組織中ICAM－1表達增強，預示了ICAM－1與淋巴結轉移有密切關系，可能是ICAM－1與LFA－1結合后，隨著淋巴細胞的轉移進入血液循環，在毛細血管或淋巴竇內滯留和著床，形成轉移灶，有利于淋巴細胞黏附血管內皮細胞并向鄰近組織侵襲。

本實驗發現，STAT1和ICAM－1在肺癌組織中的表達與癌細胞的侵襲和轉移密切相關。這提示檢測STAT1和ICAM－1水平有助于判斷肺癌患者的病情，期待能為臨床上肺癌轉移及預后判斷和基因治療提供實驗室依據。而隨著肺癌的臨床病理進展(III～IV期)，STAT1的表達下降，相應的免疫監視功能亦下降，具體機制還有待探討和明確。本次研究發現STAT1在肺癌早期中的表達高于晚期，而ICAM－1則剛好相反，STAT1通過何種途徑怎樣具體調節ICAM－1的表達，從而在不同的肺癌分期及病理類型中有差異，還有待研究。

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