miR－183在人乳腺癌中表達及意義*

吳正升， 吳 強

(安徽醫科大學病理學教研室，安徽合肥230032)

腫瘤的侵襲和轉移是其難以根治和患者死亡的主要原因。腫瘤侵襲轉移是一個復雜的和多步驟的過程，很多因子參與了這一過程。近年來，研究發現微小RNA(microRNA，miRNA)也參與了多種惡性腫瘤的發生和發展過程，它們通過調控其靶基因的表達在細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉移等很多過程中發揮了重要作用［1－3］。本課題組前期通過miRNA芯片檢測了不同侵襲活性的人乳腺上皮細胞株的miRNA表達譜，發現很多miRNA出現了顯著的差異性表達，可能與乳腺細胞侵襲活性有一定的關系［4－5］。在這些差異性表達的miRNA中包括了miR－183，其表達在高侵襲乳腺癌細胞MDA－MB－231和MDA－MB－468中較低侵襲細胞MCF－7和HBL－100顯著下調。在本研究中，我們將首先使用實時定量PCR方法驗證前期芯片中miR－183的表達結果，同時進一步檢測臨床人乳腺癌和良性病變組織中miR－183表達。然后，我們將在體外以乳腺癌MCF－7和MDA－MB－231細胞為模型，使用miRNA轉染技術，分析miR－183對乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移活性的影響，試圖為認識乳腺癌的侵襲和轉移提高新的理論線索。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株和病人材料 人乳腺上皮細胞系HBL－100，人乳腺癌細胞系MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468均購自美國典藏細胞庫(ATCC);收集安徽醫科大學第一附屬醫院2009年7月～2010年6月間乳腺病例29例，其中乳腺癌18例，乳腺良性病變(纖維腺瘤和/或腺病)11例，患者均為女性，所有患者術前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。所有新鮮組織切除后快速置于液氮速凍后儲存于－70℃，直到RNA的抽提。

1.2 主要試劑 RPMI－1640培養基、L15培養基和DMEM高糖培養基購自Corning;胎牛血清購自Hy-Clone;miRNA提取試劑盒和miR－183模擬物(mimic)、熒光定量PCR檢測試劑盒均購自Ambion;脂質體轉染試劑購自Invitrogen;miR－183模擬物(mimic)、抑制物(inhibitor，即反義寡核苷酸，antisense oligonucleotide，ASO)和陰性對照(negative control，NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司;MTS細胞增殖檢測試劑盒購自Promega;侵襲小室購自Corning;基質膠購自BD。

2 方法

2.1 檢測細胞株和新鮮組織中miR－183的表達HBL－100細胞培養于DMEM培養基中，MCF－7細胞培養于RPMI－1640培養基中，MDA－MB－231和MDA－MB－468細胞培養于L15培養基中，均添加10%胎牛血清。10 cm細胞培養皿隔天傳代擴增HBL－100、MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468細胞，待細胞狀態良好，近90%融合時，以預冷PBS沖洗3次終止培養，冰上用刮棒刮取細胞，移入離心管，4℃、8 000 r/min離心10 min，去上清，收集細胞，備用;取乳腺新鮮組織100 mg，置于液氮預冷處理的研缽中，固化、研碎，備用。按照miRNA提取試劑盒說明，分別抽提4株細胞系和乳腺新鮮組織中總miRNA。按照Ambion公司的mirVanaTMqRT－PCR miRNA檢測試劑盒說明，首先對各個細胞系和新鮮組織總miRNA進行逆轉錄，然后在實時定量PCR儀上進行PCR擴增，使用U6作為內參照。

2.2 miR－183 ASO和mimic的轉染 選擇乳腺癌細胞MCF－7和MDA－MB－231為模型，細胞接種后24 h，待貼壁細胞達到30%～50%時進行轉染，參照脂質體轉染試劑說明書轉染miR－183 ASO、miR－183 mimic和NC。

2.3 細胞增殖活性的檢測 取轉染36 h后miR－183 ASO組和NC組MCF－7細胞，以及miR－183 mimic組和NC組的MDA－MB－231細胞，按照MTS細胞增殖檢測試劑盒說明，分別于接種96孔板后24、48、72和96 h各檢測1次。每組設6個復孔。實驗重復3次。

2.4 細胞侵襲和遷移活性的檢測 取轉染48 h后miR－183 ASO組和NC組MCF－7細胞，以及miR－183 mimic組和NC組的MDA－MB－231細胞，在Transwell小室接種細胞前1 d，在小室底部膜的上室面鋪基質膠(遷移實驗不加基質膠)，按照Transwell小室說明，將侵襲小室下室加入含10%FBS RPMI－1640培養基，將侵襲小室上室加入各組細胞懸液。將侵襲小室置于37℃、5%CO2培養箱培養24～48 h，倒置顯微鏡下觀察侵襲小室下室，待少量細胞穿出后終止實驗。用棉簽擦去基質膠和上室內細胞，4%多聚甲醛固定，0.25%考馬斯亮藍染色。正置顯微鏡下進行觀察拍照，采用5個視野進行細胞計數，取平均值進行統計學分析。

3 統計學處理

采用SPSS 10.0進行統計學處理。臨床乳腺病變組織中miR－183的表達用中位數(median)、四分位數間距(interquartile range)和極差(range)表示，組間比較用Wilcoxon秩和檢驗;其余數據用均數±標準差(±s)表示，兩組間均數比較用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 miR－183在乳腺上皮細胞系和臨床乳腺病變組織中表達

本課題組前期使用miRNA芯片檢測了人乳腺細胞系 HBL－100、MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468的miRNA表達譜［4－5］，其中高侵襲細胞系MDA－MB－231和MDA－MB－468中miR－183表達均較低侵襲HBL－100和MCF－7細胞顯著下調，見圖1。本研究進一步使用實時熒光定量PCR方法檢測了這4株細胞miR－183表達，其結果與芯片結果一致，即MDA－MB－231和MDA－MB－468細胞中miR－183表達較HBL－100和MCF－7細胞顯著下調(P＜0.01)，見圖1。18例人新鮮乳腺癌組織miR－183表達也較11例乳腺良性病變組織顯著下調(P＜0.01)，見圖2。

Figure 1.Expression of miR－183 in human breast cell lines detected by miRNA microarray and real－time PCR s.n=3.＊＊P＜0.01 vs HBL－100 or MCF－7.圖1 miR－183在人乳腺上皮細胞株中表達

Figure 2.Expression of miR－183 in human breast disease tissue specimens.The data were presented as box plot (bold horizontal lines within the boxes represent the medians;lower and upper borderlines of the boxes represent the 1st and 3rd quartiles，respectively;lower and upper whiskers represent the minimum and maximum，respectively).＊＊P＜0.01 vs benign breast disease.圖2 miR－183在臨床人乳腺病變組織中表達

2 miR－183對乳腺癌細胞MCF－7和MDAMB－231增殖活性的影響

miR－183 ASO組與NC組相比，miR－183 mimic組與NC組相比，各個時點細胞的增殖數目差異均無統計學意義(均P＞0.05)。

3 miR－183對乳腺癌細胞侵襲和遷移活性的影響

如圖3所示，通過轉染miR－183 ASO下調MCF－7細胞內源性miR－183表達，能夠顯著促進乳腺癌細胞穿過基質膠的侵襲能力，以及遷移至小室膜的能力(未加入基質膠的遷移實驗)，即細胞的侵襲和遷移能力均較對照組顯著提高(均P＜0.01);如圖4所示，通過轉染miR－183 mimic上調MDAMB－231細胞內源性miR－183表達，能夠顯著抑制乳腺癌細胞穿過基質膠的侵襲能力，以及遷移至小室膜的能力，即細胞的侵襲和遷移能力均較對照組顯著降低(均P＜0.01)。

討論

Figure 3.Migration and invasion assay on MCF－7 cells transfected with miR－183 ASO and negative control.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs negative control.圖3 MCF－7細胞轉染miR－183抑制物和陰性對照后的遷移和侵襲實驗

Figure 4.Migration and invasion assay on MDA－MB－231 cells transfected with miR－183 mimic and negative control.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs negative control.圖4 MDA－MB－231細胞轉染miR－183模擬物和陰性對照后的遷移和侵襲實驗

miRNAs不僅在調控生物體各種生理活動和生長發育中發揮重要作用，而且與腫瘤的發生發展也有著密切關系［2－3，6－7］。miRNA在乳腺癌方面的研究也是研究熱點之一。Valastyan等［8］使用動物實驗發現了miR－31可以通過調控RhoA等3個靶基因表達抑制乳腺癌細胞的局部侵襲和遠處轉移。Gregory等［9］發現miR－200家族成員通過作用于ZEB1和SIP1調節乳腺癌細胞上皮－間質轉化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)過程，二者是E－cadherin的轉錄抑制因子。Sempere等［10］用原位雜交的方法檢測了乳腺組織中miR－205的表達，發現miR－205只在正常肌上皮細胞中表達，而在乳腺惡性病變區的肌上皮細胞中表達量下調甚至完全消失，說明miR－205表達量的減少可能與乳腺腫瘤的惡性演進有關。Foekens等［11］利用miRNA表達譜分析研究了38例雌激素受體陽性無淋巴結轉移的乳腺癌樣本，發現4種miRNAs(miR－7、miR－128a、miR－210和miR－516－3p)與乳腺癌的演進有關。Ma等［12］研究發現，miR－10b在乳腺癌細胞中顯著上調，外源性導入miR－10b可以使無侵襲力的乳腺癌細胞轉變為高侵襲力細胞，進一步發現miR－10b是通過參與Twist基因介導的轉移過程發揮作用的。這些研究結果顯示miRNA可能參與了乳腺癌的發生和發展過程。

本研究前期通過miRNA芯片技術檢測不同侵襲特性的人乳腺細胞株［4－5］，試圖篩選出可能參與乳腺癌侵襲過程的miRNA。miR－183的miRNA芯片結果顯示，高侵襲性的MDA－MB－231和MDAMB－468中miR－183表達較低侵襲HBL－100和MCF－7細胞顯著下調。為此，本研究通過實時熒光定量PCR技術驗證了miRNA芯片中miR－183表達數據，兩者結果一致，提示了miRNA芯片結果的可靠性。我們在臨床乳腺新鮮病變組織中再次檢測了miR－183的表達，結果顯示乳腺癌組織中miR－183出現了顯著下調。這些細胞株和臨床組織的結果提示miR－183的失調可能參與了乳腺癌發生和發展的過程。但miR－183具體的功能是什么，對乳腺癌細胞生物學行為有何影響，目前尚不明了。為闡明這些問題，我們使用化學合成的miR－183抑制物轉染乳腺癌細胞，人為下調細胞內源性miR－183表達，然后觀察轉染后細胞增殖、侵襲和遷移活性的改變。結果發現外源性下調miR－183對細胞增殖影響不明顯，但可以顯著促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移。Wang等［13］同樣使用miRNA芯片和實時熒光定量PCR技術檢測高轉移和低轉移肺癌細胞株miRNA表達譜，發現miR－183在高轉移肺癌細胞95C中表達顯著下調，并且發現miR－183通過調控其靶基因 Ezrin表達抑制肺癌細胞侵襲轉移。Lowery等［14］通過轉染乳腺癌細胞 miR－183前體(premiR－183)來過表達細胞內源性miR－183水平，功能實驗顯示過表達miR－183能夠顯著抑制乳腺癌細胞的遷移，結果與我們一致，提示miR－183在乳腺癌中可能扮演了抑癌基因角色，參與了乳腺癌細胞侵襲和遷移過程。

綜上所述，本研究在前期工作的基礎上，證實了miR－183失調是乳腺癌發病的一個現象，并且miR－183具有抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移的功能，提示miR－183可能參與了乳腺癌的發生和進展。

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