慢病毒介導的靶向沉默胰島素樣生長因子1型受體的siRNA對人子宮內膜癌細胞遷移和侵襲能力的影響*

萬 璟， 李小毛△， 舒珊榮， 張 宇

(1中山大學附屬第三醫院婦科，廣東廣州510630;2廣州華僑醫院婦產科，廣東廣州510632)

子宮內膜癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年來國內外發病率均有上升趨勢。盡管多數子宮內膜癌為分化較好的腺癌，早期診斷和早期治療預后好。但一旦發生腫瘤的侵襲和轉移后，患者治療效果和預后都明顯較差，據統計，發生轉移后子宮內膜癌患者的5年生存率不到25%［1］。探討子宮內膜癌細胞轉移和侵襲的機制，找到新的治療靶點對子宮內膜癌具有十分重要的意義。

胰島素樣生長因子(insulin－like growth factor，IGF)系統在許多惡性腫瘤中起著重要的作用，并與子宮內膜癌的發生發展有關。IGF－1與其受體(insulin－like growth factor type 1 receptor，IGF－1R)結合，激發自身磷酸化，導致下游的有絲分裂原激活的蛋白激酶通路及磷脂酶－3蛋白激酶激活，進而引起細胞的增殖和腫瘤的轉移。IGF－1R在一些腫瘤中過度表達。這些受體的過度表達，外源性肽類使腫瘤細胞轉化為不依賴于支持物生長的類型［2］。研究發現IGF－1R與腫瘤的侵襲和轉移有關，IGF－1能促進乳腺癌細胞的運動，進而促進腫瘤細胞的轉移［3］，采用反義技術阻斷IGF－1R的表達，能夠抑制鼠前列腺癌細胞的生長及轉移［4］。但IGF－1R對子宮內膜癌遷移和侵襲能力的作用仍然未知。本實驗旨在利用RNA干擾技術沉默IGF－1R基因的表達，觀察其對子宮內膜癌細胞體外遷移和侵襲能力的影響。

材料和方法

1 細胞培養

DH5α菌株，購自Promega。HEK293T細胞、人子宮內膜癌HEC－1B細胞購自中國科學院上海細胞庫，均采用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養液(含青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)培養，用含0.02%EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。傳代后取對數生長期細胞作為實驗對象。

2 主要試劑

特級胎牛血清、Opti－MEM I培養基和胰蛋白酶購于Gibco;RNA提取物Trizol購于Invitrogen;Reverse Transcription System試劑盒購于TaKaRa;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;Matrigel購于BD;Transwell小室購于Corning;MTT購于Sigma。pGCSIL－GFP質粒載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，pEGFP－N1－3FLAG質粒載體購自Becton Dickinson。鼠抗人IGF－1R購自Cell Signaling Technology;鼠抗 β－actin多克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology;細胞總蛋白提取試劑盒購自Pierce;蛋白分子質量Marker購自Fermentas。

3 siRNA設計、合成和篩選

根據IGF－1R基因序列和siRNA設計原則，設計5對siRNA序列。具體如下:siRNA1:5’－GCCGATGAGTGAGAAGACC－3’;siRNA2:5’－GCACGTCGAAGAATCGCAT－3’;siRNA3:5’－CGTTCTTTCAGCATCGAAC－3’;siRNA4:5’－CCATCAACAATGAGTACAA－3’;siRNA5:5’－GCATCACCGTTTACTACAA－3’。合成工作委托上海吉凱基因化學技術有限公司完成，利用工具細胞HEK293T篩選出3條片段有沉默作用，選取其中沉默效果最好的1條進行慢病毒包裝擴增，并轉染子宮內膜癌HEC－1B細胞，根據real－time PCR和Western blotting結果驗證其沉默效果。吉凱基因慢病毒載體系統由pGC－LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體3質粒組成。pGC－LV載體中攜帶用于研究的PTEN基因，并帶有GFP標記。

4 病毒載體穩定轉染

轉染前1 d將細胞接種到6孔板(2×105cells/ well)，待第2 d細胞密度為40%～50%進行轉染;將每個6孔板中的舊培養基吸盡，用不含血清的培養基洗滌1～2次;然后每個6孔板中加入1.5 mL的無血清培養基;HEC－1B細胞按感染復數(multiplicity of infection，MOI)為50進行慢病毒轉染，分別設對照組(HEC－1B－CON)、目的基因病毒轉染組(HEC－1B－KD)及陰性病毒轉染對照組(HEC－1B－NC);轉染8 h后將無血清培養基換為含10%胎牛血清的培養基繼續培養。

5 Real－time PCR檢測

轉染后5 d，用Trizol抽提總RNA，變性電泳，測定A260及A280值，調整總RNA濃度為1 g/L，－80℃保存備用。根據IGF－1R、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases－2，MMP－2)和基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinases－9，MMP－9)序列設計合成引物，β－actin為內參照(表1)。先以總RNA為模板進行逆轉錄反應，然后以 cDNA為模板采用TaKaRa的real－time RT－PCR試劑盒在ABI 7700熒光PCR儀上進行real－time RT－PCR反應，PCR反應條件為預變性95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 30 s，40個循環。Real－time PCR擴增完畢進行熔解曲線分析，采用相對定量法以β－actin為內參照，利用Ct值計算各基因mRNA的相對量。目的基因mRNA相對表達量用2－ΔCt來表示(ΔCt由目的基因的Ct值減去β－actin的Ct值)。

表1 IGF－1R、MMP－9和MMP－2的引物序列Table 1 .The primers for IGF－1R，MMP－9 and MMP－2

6 Western blotting檢測

轉染后第7 d，提取1×106個細胞的蛋白，紫外分光光度計定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印至硝酸纖維素膜上，常規進行免疫印跡實驗操作，IGF－1R兔抗1∶1 000和β－actin兔抗1∶1 000稀釋及羊抗兔Ⅱ抗抗體孵育，增強發光(ECL)顯色。對膜上的免疫復合物條帶進行分析，IGF－1R蛋白的相對表達水平為IGF－1R蛋白條帶密度/β－actin條帶密度。

7 平板集落形成實驗

轉染5 d后，將3組細胞按每個皿5 000個細胞密度接種到10 cm細胞培養皿中，置于37℃、5% CO2培養箱連續培養18 d后中止培養。細胞經甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下計數細胞克隆數。實驗設3個平行樣品，重復3次，結果取平均值。

8 細胞遷移實驗

轉染后第7 d，細胞培養至對數生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養基先后洗滌1次，用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度為1×108/L;使用Transwell小室，在下室加入600 μL含10%血清的培養基上室加入100 μL細胞懸液，繼續在孵箱培養24 h;取出Transwell用PBS洗2遍，甲醇固定，室溫20 min;加入結晶紫(0.1%)染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下取10個隨機視野計數，每個標本重復3次。

9 細胞侵襲實驗

轉染第7 d，提前準備好基質膠，將凍存于－80℃冰箱的BD Matrigel 4℃過夜(24 h)，變成液態;取無血清培養基，加入Matrigel(20%)，混勻(冰上操作)，加入上室，每孔100 μL;放入37℃培養箱中，孵育5 h;消化細胞，無血清培養基洗3次，計數，配成細胞懸液;調整濃度為5×109/L;下室中加入10% FBS條件培養基;上室每孔加入100 μL細胞懸液;37℃培養箱中，孵育24 h;取出Transwell小室用PBS洗2遍，甲醇固定，室溫20 min;加入結晶紫(0.1%)染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下取10個隨機視野計數，每個標本重復3次。

10 統計學處理

用SPSS 11.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 siRNA序列篩選

將HEK293T細胞作為實驗篩選細胞，轉染后提取RNA進行檢測，結果見圖1。篩選出siRNA1、2、4、5均能降低IGF－1R mRNA水平至30%以下，選取沉默效果最好的siRNA1進行慢病毒包裝擴增。

Figure 1.Expression of IGF－1R mRNA in HEK293T cells after different siRNA transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs CON and NC.圖1 轉染后各組細胞IGF－1R mRNA的表達

2 細胞轉染效率的檢測

HEC－1B細胞轉染后5 d可見較多特異性GFP綠色熒光的表達，表明我們的轉染相對成功，見圖2。

Figure 2.Expression of green fluorescent protein in HEC－1B cells 5 days after transfection(×100).圖2 轉染后5 d HEC－1B細胞綠色熒光蛋白的表達

3 轉染siRNA后HEC－1B細胞中IGF－1R mRNA水平和蛋白水平的變化

在轉染后第5 d，分別提取各組細胞的mRNA，進行檢測驗證其沉默效果，結果顯示，siRNA1序列能使HEC－1B細胞的IGF－1R在mRNA水平下降81%。在轉染后第7 d，提取細胞蛋白進行Western blotting檢測，發現HEC－1B－KD組細胞IGF－1R蛋白水平下降91.5%(P＜0.05)，見圖3、4。通過上述驗證實驗，證明靶點序列能有效降低HEC－1B細胞中IGF－1R的表達，保證后續實驗的順利進行。

Figure 3.Expression of IGF－1R mRNA in HEC－1B cells after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1BCON and HEC－1B－NC.圖3 轉染后HEC－1B細胞IGF－1R mRNA的表達

Figure 4.Expression of IGF－1R protein in HEC－1B cells after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1BCON and HEC－1B－NC.圖4 轉染后HEC－1B細胞IGF－1R蛋白的表達

4 慢病毒穩定轉染后HEC－1B細胞克隆形成能力的變化

穩定轉染后進行平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力，結果發現HEC－1B－KD組細胞形成克隆數目(153±11)明顯少于HEC－1B－CON細胞(471 ±7)和HEC－1B－NC細胞(461±11)(P＜0.05)，而HEC－1B－CON與HEC－1B－NC組細胞之間沒有明顯差異，見圖5。

Figure 5.Colony formation ability of HEC－1B cells after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖5 轉染后HEC－1B細胞的克隆形成能力變化

5 慢病毒穩定轉染后HEC－1B細胞遷移和侵襲能力的變化

轉染7 d后，HEC－1B－KD組遷移細胞相對于HEC－1B－CON組和HEC－1B－NC組明顯減少(P＜0.05)，而HEC－1B－CON組和HEC－1B－NC組沒有明顯差異，見圖6;HEC－1B－KD組侵襲細胞相對于HEC－1B－CON組和HEC－1B－NC組亦有明顯減少(P＜0.05)，見圖7。這些結果提示由于IGF－1R表達受到明顯抑制，子宮內膜癌細胞HEC－1B的遷移和侵襲能力也受到不同程度的抑制。

6 慢病毒穩定轉染后HEC－1B細胞MMP－2和MMP－9 mRNA水平的變化

慢病毒轉染7 d后，HEC－1B－KD組細胞MMP－2及MMP－9 mRNA水平明顯下降(P＜0.05)，分別下降了76%和86.5%，見圖8。

Figure 6.Inhibition of HEC－1B cells migration after downregulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖6 轉染后HEC－1B細胞遷移能力的變化

Figure 7.Inhibition of HEC－1B cells invasion after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖7 轉染后HEC－1B細胞的侵襲能力變化

討論

IGF是一類十分重要的生長因子，具有促進細胞增殖、分化等多種生物學活性，參與多種惡性腫瘤的發生與發展過程，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、結直腸癌、腎癌、黑色素瘤等［5］。IGFs系統是一個龐大的家族，包括IGF－1、IGF－2及其受體IGF－1R、IGF－2R和至少6種胰島素樣生長因子結合蛋白(IGF－binding protein，IGF－BP)。

Figure 8.Inhibition of MMP－2 and MMP－9 mRNA expression in HEC－1B cells after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖8轉染后HEC－1B細胞MMP－2和MMP－9的表達

IGF－1是酪氨酸激酶生長因子受體家族的成員，由細胞外的2個α亞單位及細胞內2個β亞單位通過二硫鍵結合形成的二聚體。一旦生長因子結合于該受體，受體β亞單位發生自身磷酸化，同時誘導胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)家族相應銜接蛋白的募集。其中IRS1的激活與腫瘤的增殖和凋亡有關，而IRS2與腫瘤的遷移和轉移有關［6］。

IGF－1在多種腫瘤的發生發展過程中起重要作用，已成為腫瘤治療的新靶點。很多研究數據表明，IGF－IR能調節腫瘤細胞的生長、增殖、代謝。對不同腫瘤的研究發現，抑制IGF－1R水平不僅影響裸鼠腫瘤的生長，還能影響腫瘤的轉移。降低結腸癌細胞中IGF－1R的表達后，在裸鼠肝臟上成瘤率明顯降低。而在過表達IGF－1R的胰腺癌裸鼠模型中，腫瘤的侵襲力和淋巴轉移都顯著增加。降低前列腺癌中IGF－1R的表達后腫瘤的生長和轉移能力都明顯被抑制。在最近的一項研究當中，使用抗IGF－1R表達的抗體作用于裸鼠模型，發現在不影響原發瘤生長的情況下，可以抑制腫瘤的遠處轉移。上述研究均提示IGF－1R在腫瘤的轉移當中起著重要的作用［7］。

IGF－1R在子宮內膜癌中同樣表達異常。Mc-Campbell研究發現高表達和活化的IGF－1R與子宮內膜不典型增生和子宮內膜癌的發生密切相關［8］。Pavelié的研究發現IGF－1R在III、IV期子宮內膜癌中的表達顯著高于I、II期及正常子宮內膜。提示IGF－1R可能與子宮內膜癌的發展有關［9］。本課題組先前研究過沉默IGF－1R表達對子宮內膜癌有增殖抑制作用，并能增加細胞凋亡［10］，但沉默IGF－1R是否能影響子宮內膜癌的侵襲和轉移仍然未知。本實驗采用RNA干擾技術，使用慢病毒載體，穩定沉默IGF－1R基因的表達，觀察了IGF－1R水平降低對子宮內膜癌細胞侵襲能力的影響。結果提示，在細胞遷移實驗中，KD組的細胞遷移能力顯著下降，在基質侵襲實驗中，轉染組穿膜細胞較未轉染組和載體對照組明顯減少，具有顯著意義。表明沉默IGF－1R表達可明顯降低子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲能力。

MMPs是一類依賴Zn2+和Ca2+并可降解細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)的蛋白水解酶類［11］。其中MMP－2、MMP－9是MMPs超家族的重要成員，屬明膠酶類，能降解明膠、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、彈力纖維等，其能通過蛋白水解酶的作用降解間質結締組織和基底膜成份，還可以對生長因子、細胞表面受體、細胞黏附分子或趨化因子的剪切作用來影響腫瘤細胞的生物學行為，在腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用［12－13］。MMP－2和MMP－9與子宮內膜癌的的侵襲轉移有十分密切的關系，且隨病理分級增高、肌層浸潤加深及臨床分期升高而呈增加趨勢［14－15］。在我們的實驗中，同時KD組中與侵襲轉移能力相關的MMP－2和MMP－9水平明顯下降，提示IGF－1R可能通過影響MMPs的水平來調節子宮內膜癌細胞的侵襲能力。

綜上所述，特異靶向IGF－1R的干擾片段能有效抑制子宮內膜癌HEC－1B細胞內源性IGF－1R的表達，降低IGF－1R的表達能抑制子宮內膜癌的遷移和侵襲能力，同時能影響MMP－2和MMP－9的水平。IGF－1R可能成為抑制子宮內膜癌發生、發展、侵襲的的分子治療靶點。

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