丙型肝炎病毒核心蛋白對HepG2細胞生長周期的影響*

羅 瓊， 姜 儻， 陳 景， 肖定璋△

(廣東省人民醫院1血液科，2醫學研究中心，廣東廣州510080;3中山大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州510080)

據WHO統計，目前全世界丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的感染率為3%［1］，約1.7億人感染丙型肝炎病毒。我國一般人群中抗HCV的陽性率為3.2%，感染人數約4000萬。統計分析表明55%～85%HCV感染者不能清除病毒而轉為慢性感染;丙肝一旦慢性化，10%～20%患者在20～30年內發展為肝硬化，1%～7%將發展為肝癌［2］。與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染一樣，丙型肝炎感染病毒是導致肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要危險因素，我國目前已能有效控制乙型肝炎病毒感染，但丙型肝炎感染卻依然呈上升趨勢，值得高度重視。

HCV基因1b亞型是目前感染最普遍的類型，已有充分證據表明HCV1b型與慢性持續性感染、肝硬化和肝細胞癌有密切關系［3－6］。HCV感染引起慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌是一個長期復雜的過程，在這個過程中，HCV核心蛋白通過影響多條細胞內信號轉導通路，使受感染的細胞反復出現損傷與再生，最終導致纖維化或癌細胞出現。由于HCV－1b基因亞型的感染具有普遍性與典型性，所以成為國內外的研究熱點。

我們構建了丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV－core－1b)基因真核重組質粒，利用此質粒轉染HepG2細胞株，獲得穩定表達HCV－core－1b的HepG2細胞株。采用流式細胞技術檢測細胞周期的變化，采用Western blotting檢測細胞cyclin D1和pRb/p130的表達水平，探討丙肝病毒慢性感染的內在機制。

材料和方法

1 材料

1.1 質粒與菌株 大腸桿菌DH5α購自TaKaRa。表達載體pBabe－Flag－puro由本研究室改造構建。

1.2 試劑與材料 pLXSN－HCV－core－1b由加拿大McGill大學Rongtuan Lin教授惠贈，屬HCV1b亞型，cDNA全長576 bp。限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ和Pfu聚合酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa。質粒小量提取試劑盒購自上海Tiangen。質粒純化試劑盒購自Qiagen。PCR引物合成及序列測定，由上海博尚生物技術有限公司完成。DNA marker DL2000購自TaKaRa。蛋白預染marker購自Fermentas。丙烯酰胺、N，N'－亞甲叉雙丙烯酰胺、TEMED均購自Sigma。Falg及anti－GAPDH鼠單克隆抗體均購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 pBabe－Flag－puro質粒擴增 pBabe－Flagpuro質粒轉化至感受態細胞，制備含100 μg/L氨芐青霉素LB瓊脂糖平板，將轉化菌涂于平板上，37℃倒置培養，第2 d挑取轉化菌落，經LB液體培養基過夜擴增培養后，按質粒提取試劑盒說明書提取pBabe－Flag－puro質粒，用于后續實驗。

2.2 引物設計及合成 從 PubMed/Nucleotide－ AF165052獲取編碼hepatitis C virus subtype 1b的ORF全長序列，根據pBabe－Flag－puro載體設計HCV－core－1b克隆引物。為便于隨后的定向克隆，在上游引物5’端添加限制性內切酶EcoRⅠ識別序列(下畫線)和起始密碼子ATG(斜體)，在下游引物添加限制性內切酶SalⅠ識別序列(下畫線)和終止密碼子TAG(反義)。目的片段為576 bp，引物合成由博尚公司合成完成。引物分別位于閱讀框前后的兩端，即:上游引物5’－ATATGAATTCCATGAGCACAAATCCTAAACCTCA－3’，下游引物5’－ATAGGTCGACCTAAGCGGAAGCTGGGATG－3’。

2.3 獲取HCV－core－1b全長cDNA目的片段以pLXSN－HCV－core－1b為模版，采用高保真Pfu酶進行PCR擴增。PCR反應體系:總體積100 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物各10 pmol/L，常規量dNTPs，Mg2+及Pfu酶，10×PCR buffer。反應條件: 94℃ 預變5 min后，94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃2 min，循環30次，72℃ 10 min，4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按上海Tiangen公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段DNA。

2.4 pBabe－Flag－puro－HCV－core－1b表達質粒的構建及序列測定 pBabe－Flag－puro載體與PCR產物分別用EcoRⅠ和SalⅠ酶進行雙酶切。純化酶切產物，用T4DNA連接酶(TaKaRa)將pBabe－Flag－puro載體與目的片段進行連接反應，于16℃連接過夜。采用氯化鈣制備DH5α感受態菌，將7 μL重組質粒與200 μL DH5α感受態菌充分混勻，冰浴30 min，置42℃水浴90s，再冰浴2 min。然后加入LB培養液800 μL，37℃振搖45 min，接種于LB+氨芐青霉素瓊脂培養皿中，37℃下培養16h。挑取細菌克隆，接種于含 Amp100 μg/L的LB培養基中置37℃振搖培養擴增，搖菌過夜。取2 mL菌液，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，經酶切鑒定篩選重組質粒陽性克隆。酶切鑒定正確的重組質粒陽性克隆接種于氨芐青霉素+LB培養液中，置37℃振搖培養，大量擴增。使用質粒純化試劑盒大量制備質粒DNA。送上海博尚生物技術有限公司測序鑒定，將測序獲得序列在GenBank上進行BLAST比較分析，并與HCV－core－1b序列比較。

將構建的測序正確的融合基因重組質粒命名為pBabe－Flag－puro－HCV－core－1b，以同樣方法獲得的載體對照質粒命名為pBabe－Flag－puro。

2.5 質粒大量提取以備用轉染 采用質粒純化試劑盒大量制備質粒DNA。

2.6 重組質粒轉染病毒包裝細胞株和重組質粒病毒感染靶細胞

2.6.1 采用脂質體轉染技術將新構建的重組質粒轉染病毒包裝細胞Pheonix 293T。

2.6.2 采用Puromycin篩選上述包裝細胞，獲得高分泌HCV－core－1b病毒的包裝細胞株。

2.6.3 HepG2細胞株接種到6孔板中，加入3 mL Phoenix－pBabe－Flag－HCV－core－1b細胞上清濾液并加入6 mg/L polybrene，37℃、5%CO2條件下培養，重復感染2次，繼續培養48 h，更換含1 mg/L嘌呤霉素的完全培養基篩選培養，每3～4 d換液一次，約30 d后篩選完成。同時感染pBabe－Flag空載體作為對照。細胞擴增、傳代，所產生的細胞株經Western blotting檢測后Flag－HCV－core－1b過表達者命名為HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b，對照組命名為HepG2－pBabe－Flag－mock。本研究中的實驗組，是選取多個Flag－HCV－core－1b過表達細胞克隆混合后組成的，以避免極性誤差。對照組也是由多克隆組成。

2.7 Western blotting檢測重組Flag－HCV－core－1b蛋白及其它相關蛋白的表達 將轉染完成HepG2細胞株后輕輕混勻后置37℃、5%CO2孵箱培養48 h。同時轉染pBabe－Flag空載體作為對照。用適量細胞裂解液裂解。采用Bio－Rad蛋白分析液檢測蛋白濃度。以50 μg/well總蛋白上樣，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質轉移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS(0.1mol/L Tris－HCl，pH 7.5，0.2%NaCl;0.05%Tween20)室溫封閉1～2 h，TTBS漂洗5 min×3次，分別加入anti－Flag小鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)cyclin D1、p130、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜。TTBS漂洗5 min×3次;鼠抗辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)37℃孵育1 h;TTBS漂洗5 min ×3次;采用Sper－Signal Weste Femto敏感曝光試劑盒，增強化學發光反應(ECL)曝光底片顯影。實驗重復3次以上，并采用Quality one軟件分析。

2.8 流式細胞儀分析HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b細胞的細胞周期 將HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b細胞分別用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1∶1)消化細胞，制備單個細胞懸液，并用預冷的PBS洗滌2次。70%乙醇固定洗后沉淀的細胞，置－20℃過夜。經300×g離心5 min，細胞重懸于含 1 g/L RNase A的PBS緩沖液中，置37℃孵育30 min。調整細胞濃度5×108cells/L，加入流式細胞儀(FCM)專用分析試管中，每管100 μL，用ProfileⅡ型流式細胞儀，在488 nm激發波長下測定細胞DNA，用Multicycle軟件分析細胞周期分布情況。

3 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件，兩組數據比較采用兩獨立樣本t檢驗，數據以均數±標準差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Flag－HCV－core－1b表達質粒的篩選及序列測定

重組質粒pBabe－Flag－HCV－core－1b經限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果，在570 bp處出現特異性擴增條帶，片段大小與預期值相符，且無非特異性擴增帶，初步判斷此條帶為576 bp的HCV－core－1b目的條帶。而空載體pBabe－Flag－mock未見條帶出現，初步表明載體構建成功，見圖1。

Figure 1.PCR results for constructed pBabe－Flag－HCV－core－1b.1:pBabe－Flag vector;2:pBabe－Flag－HCV－core－1b(digested by EcoRⅠand SalⅠ);M:marker.圖1 重組質粒pBabe－Flag－HCV－core－1b的PCR結果

2 序列分析

將重組質粒pBabe－Flag－HCV－core－1b擴增純化后送上海博尚生物有限公司測序，測序得到的克隆基因序列與文獻報道［4］一致，表明重組質粒構建成功，見圖2。

3 重組質粒pBabe－Flag－HCV－core－1b轉染HepG2細胞，Western blotting檢測Flag－HCV－core－1b蛋白的表達

Western blotting實驗表明，anti－Flag抗體檢測pBabe－Flag－HCV－core－1b轉染HepG2細胞，其蛋白提取物在分子量22 kD顯現條帶，未轉染組與空載體轉染對照組22 kD處未見條帶，GAPDH蛋白內參照顯示各泳道蛋白量基本等量，見圖3。

Figure 2.Sequence analyze of pBabe－Flag－HCV－core－1b圖2 pBabe－Flag－HCV－core－1b測序結果

Figure 3.Detection of HCV core protein expression in HepG2 cells.圖3 Western blotting檢測HepG2細胞Flag－HCV－core－1b蛋白的表達

4 HCV－core－1b過表達對HepG2細胞生長周期的影響

HepG2細胞過表達HCV－core－1b，細胞生長顯著受到抑制。流式細胞儀分析細胞生長周期發現，HepG2－pBabe－Flag－mock細胞G0/G1期比例為50.58%±1.94%，S期為42.13%±1.34%;而 HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細胞G0/G1期比例為 71.80% ±3.12%，S期為 17.12% ± 0.98%;兩組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖4。

5 HCV－core－1b的過表達抑制HepG2細胞cyclin D1的表達

比較 HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細胞中cyclin D1表達發現，轉染組和未轉染組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖5。

6 HCV－core－1b蛋白抑制Rb磷酸化，抑制HepG2細胞中pRb/p130的表達

比較 HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b細胞中pRb/p130表達發現，轉染組和未轉染組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖6。

Figure 4.Effect of overexpression of HCV－core－1b on cell cycle progression of HepG2 cells.圖4 流式細胞儀檢測HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細胞生長周期的結果

討論

丙肝病毒在細胞內持續感染是慢型肝炎重癥化、肝硬化和肝細胞癌的發生基礎。在丙肝慢性感染過程中，肝臟損傷與再生反復交替發生，病變組織可見變性細胞、活躍增殖的病變細胞與肝硬化結構［7－8］，說明HCV感染造成肝細胞損傷的同時，促衍進肝細胞再生和部分細胞纖維化改變，最終導致肝細胞纖維化和肝癌。已有研究認為HCV－core－1b型與慢型肝炎重癥化、肝硬化和肝細胞癌有密切相關［3－6］，但其內在機制并不完全明了。

Figure 5.Inhibition of cyclin D1 by core protein in HepG2 cells.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs HepG2.△△P＜0.01 vs HepG2－pBabe－Flag－mock.圖5 Western blotting檢測HCV－core－1b過表達對HepG2細胞cyclin D1表達的影響

Figure 6.Inhibition of pRb/p130 by core protein in HepG2 cells.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2.△△P＜0.01 vs HepG2－pBabe－Flag－mock.圖6 Western blotting檢測HCV－core－1b過表達對HepG2細胞pRb/p130表達的影響

HCV－core是HCV的結構蛋白，在各亞型HCV病毒中高度保守，由191個氨基酸組成。丙肝核心蛋白不僅參與調節HCV病毒RNA翻譯、病毒粒子組裝，與糖蛋白作用產生完整的病毒粒子。還參與細胞內蛋白的相互作用、影響細胞中信號轉導與脂質代謝、調控細胞漸進性死亡或凋亡、促進細胞生長和永生化［9］。Simmoonds［3］根據HCV核苷酸的同型程度，將HCV分為6個主要基因型，各型由若干亞型組成(即a－c)。1b亞型是目前最普遍的感染亞型。HCV－core在各亞型中高度保守，研究顯示感染丙型肝炎患者，血液中HCVcAg與HCV RNA密切相關，檢測HCVcAg是診斷HCV的金標準［10］。

本研究根據HCV－core－1b基因的開放閱讀框(ORF)，設計PCR擴增引物，采用Eco RⅠ和SalⅠ酶切PCR產物，亞克隆入pBabe－Flag－puro載體，重組質粒pBabe－Flag－HCV－core－1b經酶切及測序鑒定。采用逆轉錄病毒感染技術將新構建的重組質粒感染靶細胞HepG2，測序結果得到的克隆基因序列與文獻報道一致，Western blotting檢測蛋白的表達，anti－Flag抗體檢測見pBabe－Flag－HCV－core－1b轉染HepG2細胞，其蛋白提取物在分子量22 kD顯現條帶，未轉染組與空載體轉染對照組22 kD處未見條帶，GAPDH蛋白內參照顯示各泳道蛋白量基本等量，見圖3，說明穩定表達pBabe－Flag－HCV－core－1b的HepG2細胞株篩選是成功的。

關于HCV－core對細胞生長周期、凋亡的影響，不同學者用于實驗研究的靶細胞系不同，所得的結果不盡相同。長期慢性感染是丙肝病毒致病的典型過程，為了真實反映這一特征，我們在研究中采用基因轉染技術將HCV－core－1b基因組導入包裝細胞，再用包裝細胞分泌產生的病毒感染HepG2細胞，從而建立長期穩定表達HCV－core－1b的HepG2細胞株。HCV－core－1b－HepG2細胞株中HCV復制水平較低，與人體內病毒持續慢性感染相似，用于研究丙肝、丙肝相關的肝硬化和肝細胞癌的發生機制具備一定優勢。該細胞株自建立后一直穩定表達HCV－core－1b蛋白，為下一步研究提供了可靠的實驗基礎。

我們采用流式細胞術檢測HepG2、HepG2－pB-abe－Flag－mock以及HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細胞的生長周期，分析 HCV－core對HepG2細胞生長周期的影響，發現HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b停留 G0/G1期比例為71.80%±3.12%，S期為17.12% ±0.98%，而對照組HepG2－pBabe－Flag－mock停留在G0/G1期比例為50.58%±1.94%，S期為42.13%±1.34%;2組比較顯著差異(P＜0.01)。這提示因為HepG2細胞HCV－core－1b蛋白的表達，使HCV－core－1b (+)的細胞大部分停滯在G0/G1期，細胞從G1期向S期的轉變受到了損害，HCV－core－1b抑制了細胞的增殖，而對照組HCV－core－1b(－)的細胞增殖不受影響，大部分進入了S期。

為了進一步探討HCV－core－1b過表達影響HepG2細胞周期的機制，我們選擇了調控細胞周期具有重要意義的細胞調控分子cyclin D1和pRb/p130作為研究對象，觀察HCV－core－1b對cyclin D1和pRb/p130表達的影響。Cyclin D1屬于G1周期素，是控制G1/S細胞周期關卡的一個重要分子，G1期的推進需要cyclin D1的表達，它與cyclin D家族其他成員共同啟動程序細胞向一個階段發育。在控制G1/S期轉換過程中，cyclin D1/CDK4和cyclin D4/CDK2兩條限制性途徑起到關鍵作用，但一般認為cyclin D1/CDK4途徑更重要。因此，我們選擇cyclin D1作為觀察HCV－core生長周期的指標，采用Western blotting技術檢測 HepG2、HepG2－pBabe－Flagmock以及HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b 3組細胞cyclin D1表達的差異，結果發現HCV－core－1b蛋白過表達的HepG2細胞，其cyclin D1表達顯著下降(圖5)。這一結果與HepG2細胞生長阻滯在G0/G1期狀態是一致的。

Rb對細胞周期的調節也起到很重要作用。Rb是腫瘤抑制基因，pRb和pRb的相關蛋白(p130、p107)是CDK的主要作用底物。當生長信號通過信號轉導途徑和早期應答蛋白轉導細胞周期調控機制時，首先是cyclin D的表達增加，激活CDK4，活化的CDK4從ATP分子得到大量的磷酸基團，并將它們轉移到細胞周期主要制動分子Rb上，cyclin D/CDK使pRb磷酸化，磷酸化的pRb釋放E2F(轉錄因子)，Rb進入高磷酸化狀態，從而失去了對細胞周期的制動功能，促使細胞進入S期。當Rb處于低磷酸化狀態時，其扣留著大量的轉錄因子(如E2F)，使它們不能發揮作用，從而阻斷了細胞周期的運行。

p130是pRb的相關蛋白，為了能更好的了解HCV－core對HepG2細胞生長周期的影響，我們進而觀察HCV core對pRb/p130蛋白表達的影響。結果發現HCV－core－1b蛋白過表達的HepG2細胞，pRb/p130表達顯著下降。這一結果與HepG2細胞生長阻滯在G0/G1期狀態也是一致的(圖6)。

細胞周期的調控是細胞維持正常生長發育的必要條件，參與調節細胞生長周期的蛋白非常復雜。有許多蛋白分子參與其過程，其中包括p53、p21、pRb、E2F、c－Myc和cyclin D。有研究提示HCV－core影響細胞生長周期，但由于實驗條件不同，特別是實驗中所采用的細胞系不同，所得結論不盡一致。Ruggieri等［11］發現在非同步HCV－core穩定表達的HepG2細胞株中，HCV－core誘導c－Myc蛋白水平穩定增加，進而干擾細胞周期;Honda等［12］發現HCV－core可促進細胞生長周期的進展;Ohkawa等［13］發現HCV－core的表達，抑制CL－2細胞G1進入S期;Yan等［14］觀察Chang氏肝細胞發現，HCV－core抑制細胞生長周期，促進細胞凋亡。上述研究提示我們HCV－core的表達，可能具有雙重作用:既可促進細胞生長周期又可抑制細胞生長周期。然而HCV－core是如何促進或抑制細胞生長周期的機制尚不清楚。Yao等［15］研究證實HCV－core通過p21－CDK雙相調節途徑抑制和調節肝細胞生長周期。Classon等［16］報道HCV－core能使T淋巴細胞的CDK2/4和cyclin E/D表達下降，穩定p27信號通路，阻滯T淋巴細胞從G0期進入S期，抑制細胞增殖。Gao等［17］已報道p130的下調可延長細胞生長周期的G1期而縮短S期;Cho等［18］認為HPV、HBV、HCV、EBV、HHV－8/KSHV和HTLV－1能抑制p53和pRb的功能，誘導腫瘤細胞融合。在鼠細胞內穩定表達的HCV－core可明顯下調pRb水平和上調E2F－1，促進細胞增殖和凋亡［7］。

我們的實驗顯示HCV－core(+)HepG2細胞對cyclin D1和p130的影響是一致的，HCV－core既抑制cyclin D1又抑制p130的表達，這與我們流式細胞術檢測的HCV－core(+)HepG2細胞停滯在G0/G1期也相吻合，由于HCV－core－1b(+)的細胞cyclin D1低表達，使磷酸化p130也下降，去磷酸化的p130結合E2F(轉錄因子)，使其處于失活狀態，從而阻止細胞周期推進，最終的結果就是HCV－core－1b(+)的細胞大部分停滯在G0/G1期，而對照組HCV－core－1b(－)的細胞大部分進入了S期。

眾所周知，慢性肝炎——肝硬化——肝細胞肝癌是肝病進展的三部曲，HCV引起慢性肝炎、肝硬化和肝細胞肝癌與HCV慢性持續感染密切相關。從以上實驗結果，我們可以推測HCV－core損傷細胞生長周期，致使細胞不能從 G1期進入到 S期，使HCV潛伏在G0/G1期細胞內，G0期的細胞可以長期不增殖，但細胞處于持續病毒感染狀態，病毒在休眠的宿主細胞內反復復制，使被感染的宿主細胞不斷受損傷或使基因突變，一旦在生長因子或細胞外增殖信號呼喚下，部分攜帶HCV－core的異常細胞又能重返S期增殖，潛伏在G0/G1的HCV－core(+)異常細胞不斷向S期增殖，最終引起慢性肝炎、肝硬化和肝細胞肝癌等病變。

綜上所述，HCV－core對細胞周期具有明顯的影響，可能通過下調cyclin D1和p130阻滯細胞增殖使細胞停留在G0/G1期，從分子水平上解釋了HCV長期慢性持續感染的可能機制，為進一步研究HCV相關的慢性肝炎、肝硬化和肝細胞肝癌提供了很好的模型。

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