模擬酸雨脅迫下鈣離子對高羊茅種子發芽的影響

常青山，張利霞，萬 濤，王慶亞，王 瑞

(1.河南科技大學林學院，河南 洛陽471003; 2.河南科技大學農學院，河南 洛陽 471003; 3.景德鎮高等專科學校生化系，江西 景德鎮 333000; 4.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095；5.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095)

酸雨是當今世界面臨的重大環境污染因素之一[1]。中國是目前世界上繼歐洲和北美之后出現的第三大酸雨覆蓋區域，境內受污染的地區約占國土總面積的40%。酸雨成為目前中國面臨的極其嚴峻的環境污染問題之一[2-3]。酸雨能使人類賴以生存的生態環境發生重大改變，使土壤酸化、鹽基離子流失，導致作物根系發育嚴重受阻、活力顯著下降，并影響其對營養物質的吸收與利用，從而直接或間接地對作物的生長及產量產生不良影響[2,4-5]。一般來說，植物種子在萌發與幼苗階段極易受到酸雨脅迫的不良影響[6-7]。因此，許多緩解酸雨脅迫的相關研究均在植物種子萌發與幼苗期展開[8-9]。大量研究表明，外源鈣處理可以降低細胞膜透性、穩定細胞膜、提高抗氧化酶活性、減輕脅迫造成的氧化傷害[10-11]，可以緩解重金屬脅迫[12]、鹽脅迫[13-14]、酸雨脅迫等各種脅迫傷害[8]。

然而，外源鈣對不同脅迫緩解作用的研究多集中在農作物[12,15]與經濟作物上[16-17]，在草坪草中研究相對較少。隨著長江中下游地區城市化進程的加快，人們對城市園林綠化與生態環境的改善有了越來越高的追求，而酸雨卻成為影響城市綠化，特別是影響草坪綠化的一個重要因素[18]。因此，研究草坪草及其相關生態技術，有效緩解酸雨脅迫帶來的傷害，對酸雨地區城市生態環境保護與防治具有重要意義。高羊茅(Festucaarundinacea)作為一種綠期較長的冷季型草坪草，廣泛用于城市園林綠化、運動場草坪的建植和公路護坡等生態建設工程中，在長江中下游地區城市綠化中也有著大面積的應用[19]。本研究以高羊茅種子為材料，研究不同濃度CaCl2溶液浸種對模擬酸雨脅迫下高羊茅種子萌發特性的影響，以期為長江中下游酸雨地區高羊茅草坪建植提供理論與實踐依據。

1 材料與方法

1.1材料 高羊茅種子購自江蘇省農業科學研究院，從美國進口，室內袋裝貯藏，品種為金質克拉多。

1.2模擬酸雨的配制 根據江蘇省實測降水中SO42-與NO3-的摩爾濃度之比 (約5∶1)[20]，參照曹春信等[21]的方法制備模擬酸雨：配制0.25 mol·L-1H2SO4和0.05 mol·L-1HNO3溶液，按等體積比配制模擬酸雨的酸母液；配制濃度高于天然酸雨成分1 000倍的電解質母液，含3.1 g·L-1CaC12、8 g·L-1NH4Cl、0.91 g·L-1NaCl和0.75 g·L-1KCl。然后將電解質母液稀釋1 000倍后，用酸母液調節模擬酸雨的pH值為2.5。

1.3方法 利用RXZ-300D人工智能氣候箱(寧波江南儀器制造廠)進行種子發芽試驗。培養條件：溫度(25±1) ℃，每天光照12 h，相對濕度80%。準確稱取無水CaCl2，以去離子水配制成0(以無CaCl2的去離子水作對照)、5、10、25、50、100 mmol·L-1的 CaCl2溶液。選取籽粒飽滿、大小基本一致的高羊茅種子，用0.5%的雙氧水溶液消毒30 min，再經去離子水漂洗3次并用吸水紙吸干表面水分，然后在上述配好的各種濃度CaCl2溶液及去離子水(對照)中浸泡24 h后，用去離子水漂洗種子3次，吸水紙吸干種子表面的水分。將浸種處理過的種子放入預先鋪上2層濾紙的培養皿中，每皿50粒，4個重復，保持間距盡量一致。每個培養皿加入15 mL pH值2.5的模擬酸雨溶液進行脅迫試驗。每2 d換一次模擬酸雨溶液，每天打開2次，與外界換氣5 min，每24 h觀察記錄發芽情況；最后一天記錄最終發芽數及幼苗鮮質量、苗高與根長。本試驗采用國家標準[22]規定的高羊茅末次計數時間(第14天)，從第1天開始每天統計發芽的種子數，14 d后計算以下相關指標[23-24]：

1)發芽率(GR)=(n/N)×100%(n為最終達到的正常發芽粒數，N為供試種子數)；

2)發芽勢(GP)=(n5/N)×100%(n5為種子發芽第5天的正常發芽粒數，N為供試種子數)；

3)發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)(Gt為在t天的發芽數，Dt為相應的發芽天數)；

4)活力指數=GI×S(GI為發芽指數，S為單株鮮質量)；

5)鮮質量、苗高和根長：隨機抽取10株，計算高羊茅幼苗鮮質量單株平均值，以及苗高與根長單株平均值。

1.4質膜透性測定與計算 測量發芽第14天的正常幼苗電導率，并以相對電導率來反映幼苗的膜透性[25]。參考韓永華等[26]的方法測定幼苗電導率：從對照及不同處理中分別稱取生長一致的鮮苗0.1 g，剪成長度為0.5 cm的小段，3個重復。用去離子水充分沖洗干凈后，用吸水紙吸干水分，置于20 mL試管中，并加10 mL去離子水，搖勻、密封，室溫放置24 h，用DDB-6200型數字電導儀測定電導率E1；然后置沸水浴中煮30 min，冷卻后測定電導率E2；同時測定其背景電導值E0。按下式計算電導率(P)：

P=(E1-E0)/(E2-E0)×100%.

1.5統計分析 數據采用SPSS 13.0進行方差分析與多重比較(Duncan新復極差法)，然后采用Origin 8.0作圖。不同CaCl2處理對酸雨脅迫下高羊茅種子發芽的影響采用主成分分析與隸屬函數法進行評價[27]。

隸屬函數值計算公式:

(1)

反隸屬函數值計算公式:

(2)

式中，Xj為第j個綜合指標，Xmin、Xmax分別為第j個綜合指標的最小值和最大值。若所測指標與抗性指標正相關則采用公式(1)，反之采用公式(2)。最后用各指標的隸屬函數值乘以相應的權重系數(權重系數為負值時取絕對值)來計算綜合評定值。

2 結果與分析

2.1模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發芽率和發芽勢 在模擬酸雨脅迫條件下，經過CaCl2浸種的高羊茅種子的發芽率與發芽勢呈現先增加后降低的趨勢(圖1A、圖1B)。各處理均高于對照，其中25～100 mmol·L-1CaCl2處理與對照差異顯著(P<0.05)。隨著CaCl2溶液濃度的升高，在50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種處理下高羊茅發芽率與發芽勢達到最大，100 mmol·L-1CaCl2溶液處理開始下降，但仍高于對照。在25 mmol·L-1CaCl2溶液浸種下，高羊茅的發芽率與發芽勢分別比對照增加了12.41%和41.10%；在50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種下，高羊茅的發芽率與發芽勢分別比對照增加了21.82%和58.40%。

2.2CaCl2溶液浸種對高羊茅種子發芽指數與活力指數的影響 不同濃度的CaCl2處理對模擬酸雨脅迫下的高羊茅種子的發芽指數與活力指數影響明顯，均高于對照；隨著CaCl2溶液濃度的升高，二者均呈先上升后下降的趨勢(圖1C、圖1D)。25和50 mmol·L-1CaCl2溶液處理下發芽指數顯著高于對照(P<0.05)，分別比對照增加了23.37%和31.98%。10～100 mmol·L-1CaCl2溶液處理下的高羊茅種子活力指數均顯著高于對照，其中25和50 mmol·L-1CaCl2溶液處理下的活力指數分別比對照提高了61.86%和76.10%。

圖1 CaCl2溶液浸種對模擬酸雨脅迫下高羊茅種子發芽率(A)、發芽勢(B)、發芽指數(C)和活力指數(D)的影響Fig.1 Effects of seed soaking in CaCl2 solution on germination rate (A), germination energy (B), germination index (C) and vigor index (D) of Festuca arundinacea seeds under simulated acid rain stress

2.3CaCl2溶液浸種對模擬酸雨脅迫下高羊茅幼苗生長的影響 不同濃度下CaCl2溶液浸種處理對模擬酸雨脅迫下高羊茅種子幼苗苗高的影響明顯，均顯著高于對照(P<0.05)，25和50 mmol·L-1CaCl2處理幼苗苗高與對照相比分別增加了49.08%和56.35%，但二者差異不顯著(圖2A、圖2B)。從根長來看，除5 mmol·L-1外，其他CaCl2濃度處理下的根長均顯著高于對照，25和50 mmol·L-1CaCl2處理的根長與對照相比分別增加了10.10和6.96倍。從增加的幅度來看，CaCl2浸種處理對根長的影響高于對苗高的影響。

各處理下的幼苗鮮質量均高于對照，除5 mmol·L-1CaCl2處理外，其他處理均與對照差異顯著(P<0.05)(圖2 C)。隨著處理濃度的增加，幼苗鮮質量先增加，然后在100 mmol·L-1CaCl2處理下降低。25和50 mmol·L-1CaCl2處理可以顯著提高高羊茅種子在模擬酸雨脅迫下的鮮質量，其鮮質量分別比對照增加了34.82%和37.20%，但這兩個處理之間差異不顯著。

2.4不同濃度CaCl2浸種處理對模擬酸雨脅迫下高羊茅幼苗質膜相對透性的影響 不同濃度CaCl2溶液處理下，高羊茅幼苗的電導率均顯著低于對照(P<0.05)(圖2D)。在5～25 mmol·L-1CaCl2濃度范圍，電導率隨CaCl2處理濃度升高而降低，在25 mmol·L-1CaCl2溶液處理下，其電導率達到最低值。在50和100 mmol·L-1CaCl2處理下，高羊茅幼苗的電導率隨CaCl2濃度增加而升高，幼苗的細胞膜透性增加。25和50 mmol·L-1CaCl2處理的電導率與對照相比分別減少44.36%與32.39%。

圖2 CaCl2溶液浸種對模擬酸雨脅迫下高羊茅幼苗苗高 (A)、根長 (B)、鮮質量 (C)和電導率(D)的影響Fig.2 Effects of seed soaking in CaCl2 solution on seedling height (A), root length (B), fresh weight (C) and electrical conductivity (D) of Festuca arundinacea seedlings under simulated acid rain stress

2.5不同濃度CaCl2浸種處理對模擬酸雨脅迫下高羊茅種子萌發的綜合評定 主成分分析表明，第1主成分中，發芽率等發芽指標對應的相關系數分別為0.920、0.959、0.984、0.996、0.983、0.907、0.985和-0.913，特征根為7.319，累積貢獻率為91.49%。根據主成分的累積方差貢獻率大于80%～85%的原則[28]，選留第1主成分。發芽指數、活力指數、苗高在此成分上有較高載荷，說明鈣溶液浸種處理對模擬酸雨脅迫下的高羊茅這3個指標的影響很大。提取這一主成分基本上可以反映全部指標的信息，因此，應用這一綜合變量來代替原來的8個變量。通過計算，獲得主成分表達式：

F1=0.340x1+0.354x2+0.364x3+0.368x4+0.363x5+0.335x6+0.364x7-0.337x8。

式中，x代表主成分表達式中的主成分變量,x1為發芽率，x2為發芽勢；x3為發芽指數，x4為活力指數，x5為苗高，x6為根長，x7為鮮質量，x8為電導率。

根據主成分表達式各指標權重值的大小可以看出各指標在鈣浸種對模擬酸雨脅迫下種子發芽特性影響大小的重要性，由大到小依次為發芽指數、活力指數、苗質量、鮮質量、發芽勢、根長、發芽率、電導率。根據主成分表達式計算出各鈣溶液浸種處理的得分，5種濃度CaCl2溶液浸種處理影響耐酸雨脅迫的能力由強到弱依次為50、25、10、100、5、0 mmol·L-1(表1)。

表1 CaCl2浸種對模擬酸雨脅迫下高羊茅種子發芽特性的影響能力得分Table 1 The scores of effects of seed soaking in CaCl2 solution on germination characteristics of Festuca arundinacea seeds under simulated acid rain stress

為避免單一指標的片面性并克服多個指標的復雜性，全面而準確地評價CaCl2溶液浸種處理對高羊茅種子發芽特性及幼苗生長狀況的影響，本研究采用隸屬函數法對不同濃度CaCl2溶液浸種處理對模擬酸雨脅迫的影響進行評定，確定不同CaCl2溶液浸種處理對模擬酸雨脅迫的影響大小。依據各指標的隸屬函數值，結合主成分分析中各指標的權重值進行綜合評定，綜合評定值越大，表明鈣溶液浸種對高羊茅在模擬酸雨脅迫下發芽能力的提高作用愈明顯。由表2可知，5種鈣溶液浸種處理對酸雨脅迫下高羊茅種子發芽能力的影響由強到弱的順序依次為50、25、10、100、5、0 mmol·L-1。兩種方法分析結果的一致性說明了本研究結果科學可靠。

表2 CaCl2浸種對模擬酸雨脅迫下的高羊茅發芽各指標影響的隸屬函數分析Table 2 Subordinate function analysis of effects of seed soaking in CaCl2 solution on indices of seeds germination of Festuca arundinacea under simulated acid rain stress

3 討論

3.1鈣溶液浸種處理可以提高對模擬酸雨脅迫下的高羊茅種子發芽的數量與品質 鈣是植物的必需元素之一，在細胞伸長、分裂以及細胞膜構成、滲透性等方面具有重要作用，已有大量研究證明其可以有效提高種子的活力[10,17,29]。與對照相比，適宜的鈣溶液浸種不僅顯著提高種子的發芽勢、活力指數及幼苗的苗高、根長、鮮質量，而且降低了幼苗的電導率，說明鈣溶液浸種在提高種子發芽率的同時，種子的品質與活力也得以大幅度提高，這與前人的相關研究結果一致[8,30]。鈣溶液浸種可以提高模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發芽能力，一方面在于鈣溶液可以緩解模擬酸雨本身的酸度[31]，另一方面在于鈣可以激活H+-ATP酶增強植物對細胞質pH值的調節，同時激活部分保護酶活性，從而減輕模擬酸雨脅迫對細胞膜結構的破壞，增強細胞抗酸脅迫的能力[16,32-34]。

3.2鈣溶液浸種處理對模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發芽特性相關指標的影響作用不同 鈣處理對模擬酸雨脅迫下高羊茅發芽的各指標中的幼苗根長影響作用最大，50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種處理的根長是對照的7.96倍，其次為活力指數，50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種處理的活力指數比對照提高76.10%，該處理下的發芽勢與苗高分別比對照提高58.40%和56.35%，僅對發芽率的影響在各指標中最小，比對照提高21.82%。模擬酸雨脅迫顯著抑制草坪草根系的生長，對根長的影響要顯著大于對幼苗苗高的影響[35]，而鈣溶液浸種處理則可顯著減少模擬酸雨脅迫對幼苗苗高與根長的影響，對根長的影響作用顯著大于對幼苗苗高的影響作用。原因可能在于隨著鈣對模擬酸雨脅迫的緩解，幼苗胚根所受脅迫減輕，高羊茅種子的胚根生長速度快于胚芽，因而鈣處理表現對高羊茅根長的影響較大。在鈣處理對鹽脅迫下的高羊茅種子萌發影響的研究中，高濃度鈣處理對高羊茅種子萌發產生傷害，其處理效果甚至低于對照[30]。而在本研究中，高濃度處理雖然效果較差，但仍高于對照，原因可能在于鈣處理對酸雨脅迫的緩解效果好于對鹽脅迫的緩解效果。

3.3模擬酸雨脅迫下高羊茅種子發芽隨鈣處理濃度增大具有先促進后抑制的特點 鈣能參與膜結構的保持與修復，穩定膜脂及膜蛋白的結構，維持植物細胞內離子的平衡，保持細胞結構與功能的完整，使植物維持正常的生理活動[15,17]。添加適量的鈣，可以維持鈣信號系統的正常發生與傳遞，加強質膜的穩定性，并進一步維持細胞內離子的平衡。從本研究結果也可以看出，適宜濃度的鈣溶液浸種有效降低幼苗的電導率，減少植物體內細胞膜的損傷。而在50和100 mmol·L-1CaCl2處理下電導率則開始升高，相對增加了膜透性，原因可能在于較高濃度的鈣處理可能超過植物的吸收能力使植物造成滲透脅迫，導致細胞內的離子平衡被打破，形成類似鹽害的破壞作用從而增加膜透性[30]。

綜合分析認為，鈣溶液浸種可有效提高模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發芽能力，隨著CaCl2處理濃度的增加，高羊茅在模擬酸雨脅迫下種子發芽能力逐漸提高，但超過一定濃度后反而使高羊茅種子的發芽能力降低。其中以50 mmol·L-1CaCl2處理對模擬酸雨脅迫下的高羊茅種子發芽作用最好，本研究對于長江中下游酸雨地區高羊茅草坪建植具有一定的指導意義，至于應用于其他草坪草種是否有明顯的緩解效果則有待于進一步驗證。

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