甘肅新選育黨參品系與主栽品種的RAPD分析

楊 寧，陳錫蓮，高新彥，史萬斌，劉效瑞

(1.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州市城關區徐家山林場，甘肅 蘭州 730000；3.定西市旱作農業科研推廣中心，甘肅 定西 743000)

我國對中藥材的研究已有幾千年的歷史,中藥材資源豐富，是世界中藥材的主產國。甘肅省中藥種植歷史悠久，是全國藥用黨參(Codonopsispilosula)種植的主產區。中藥材的品質關系到臨床用藥的安全有效，發展道地藥材是實現中藥現代化的關鍵，也是占有市場、增強產品競爭力的基本保障。目前，產生道地藥材地域性現象的原因除了與栽培方法、生態環境、加工方法有關外，還與物種居群的遺傳特異性有關，這可能是造成道地藥材與非道地藥材品質差異的原因。道地藥材與非道地藥材在形態和生藥性狀等特征上的差別并不顯著，應用傳統方法鑒別道地藥材變得困難。因此，藥材道地性研究已經成為中醫藥科研的重要課題[1-2]。

黨參為桔梗科植物，黨參及其同屬多種植物的干燥根可入藥，其性味甘平、無毒，有補中益氣、生津止渴等功效。主治脾胃虛弱、中氣不足、肺氣虧虛、熱病傷津、氣短口渴、血虛萎黃、頭暈心慌等癥， 是我國傳統的補益藥[3]。甘肅黨參產量居全國之首，主要生產于甘肅的武都、文縣、宕昌、岷縣、渭源、漳縣等地[4]。目前黨參生產中，普遍使用傳統栽培育種方法，品系親緣關系不明確，缺乏品系鑒定的分子依據，這已經成為甘肅黨參產業發展的限制瓶頸之一。隨機擴增DNA多態性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術以其操作簡單、快速、花費少、DNA用量少、無放射性等優點，被廣泛應用于中草藥種質資源親緣關系鑒定、遺傳多樣性及藥材道地性研究等方面[5-8]。

本研究正是基于甘肅省黨參生產及實際銷售中不能提供科學的藥材道地性鑒定方法等問題，利用RAPD技術對甘肅省定西市旱作農業科研推廣中心新選育黨參8個品系和2個主栽品種進行分析鑒定，考證其遺傳多樣性和親緣關系，以期為甘肅省黨參的產業化發展提供部分分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料 本試驗所用10個黨參樣品由甘肅省定西市旱作農業科研推廣中心提供，采集于2010年6月。摘取10個黨參樣品的幼葉，用硅膠干燥后帶回實驗室。供試樣品編號見表1。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取 用SDS方法[9-10]提取植物基因組DNA。將足量黨參的葉片加液氮研磨，加提取液后水浴保溫，而后加入適量氯仿-異戊醇，離心后加無水乙醇使DNA析出。

1.2.2PCR擴增 反應在BIO-RAD普通型PCR儀上進行，RAPD引物由北京奧科生物技術公司生產，所用Taq酶及dNTPs購自天根生化科技(北京)有限公司。

引物篩選參照張建清等[11]的方法，略作修改。RAPD反應體系：100 ng·μL-1模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1隨機引物2 μL，2.5 μmol·L-1dNTPs 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 U·μL-1Taq酶 0.5 μL，加ddH2O至25 μL。

表1 供試材料編號、名稱和采集數Table 1 Number, name and collection quantity of the tested materials

擴增程序：94 ℃預變性5 min后，94 ℃ 1 min，34.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共計43個循環，最后72 ℃延伸10 min。

采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，UVI凝膠圖像分析系統觀察照相。每個試驗至少重復3次。

1.2.3數據處理 參照Williams等[12]的方法，電泳擴增圖譜中的每一條帶(DNA片段)均為一個分子標記(Marker)，且代表一個引物結合位點，所有位點的二元數據是通過統計標記各分子在相同電泳遷移率下(相同分子量片段)的有無得到的，有DNA擴增帶(顯性)為1，無帶(隱性)記為0，強帶和弱帶賦值為1。由NTSYS-PC 統計分析軟件系統中的Dice得到材料間的相似系數矩陣，建立系統聚類分支樹狀圖。重復試驗中能穩定出現的差異帶即多態性位點用于數據分析。

2 結果與分析

2.1RAPD多態性分析 通過篩選，從60條隨機引物中選擇譜帶清晰、重復性好、多態性較豐富的14條隨機引物用于PCR擴增反應(表2)。14條引物共擴增出159個位點，其中多態性位點比率為46.43%，不同引物的擴增位點變幅為7～16個，平均每條引物能擴增出11.4個位點，圖1為3號和5號引物的擴增結果。

表2 引物序列和擴增結果Table 2 Primers and amplified results

圖1 引物P3(左圖)和P5(右圖)擴增的RAPD帶型Fig.1 RAPD results generated by P3 (left) and P5 (right) primers

2.2遺傳距離和聚類分析 用NTSYS-PS統計分析軟件中的Dice方法得到材料間的遺傳相似性系數和遺傳距離(表3)，供試材料間遺傳相似系數(GS)值的變化范圍為0.771 9～0.964 9，其平均值為0.834 2。相似系數越大，材料間的遺傳距離越小；相似系數越小，反之親緣關系越遠。本研究所采用黨參資源為甘肅省定西市旱作農業科研推廣中心選育的8個新品系和2個主栽品種，即RAPD標記的是種間多態性，相似系數值變化范圍較小，此結論與盛麗等[13]在當歸種質資源RAPD分析中獲得的結果相似。

根據RAPD數據得到的遺傳相似系數和遺傳距離圖，按UPGMA法進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖(圖2)。DS6品系與所有其他供試材料的親緣關系最遠，可單獨聚為一類；DS3品系與DS8品種的親緣關系最近，其相似系數為0.964 9。其他黨參材料間的遺傳相似系數變化不大，表明黨參的種間遺傳關系較近。

表3 10個黨參品種(品系)間的遺傳相似性系數和遺傳距離Table 3 Genetic similarity coefficient and genetic distance among 10 Codonopsis pilosula varieties (strains)

圖2 10個黨參品種(品系)的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA cluster analysis of 10 Codonopsis pilosula varieties (strains)

3 討論與小結

3.1RAPD-PCR體系的建立 影響PCR擴增條帶的因素有模板DNA、引物、dNTPs量、Taq酶、退火溫度、電泳中的瓊脂糖質量分數、電泳時間。本試驗在前期工作中對模板DNA含量、引物含量、dNTPs含量、Taq酶含量4個因素進行了優化分析，進而建立了適合黨參材料的RAPD-PCR擴增反應體系，并對引物退火溫度和電泳中瓊脂糖質量分數進行了梯度篩選，最終確定黨參的最適RAPD-PCR體系為100 ng·μL-1模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1隨機引物2 μL，2.5 μmol·L-1dNTPs 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 U·μL-1Taq酶 0.5 μL，ddH2O 18 μL；RAPD引物最佳退火溫度為34.5 ℃，最適瓊脂糖質量分數為1.2%。此體系的建立可為其他黨參品種的RAPD擴增提供參照依據。

3.210個黨參材料間的遺傳相似性和多樣性 RAPD是一種顯性標記，能從分子水平上揭示材料間存在的遺傳差異[14-16]。本研究從60條隨機引物中篩選出譜帶清晰并呈多態性的14條引物，結果證明其穩定性較好。不同供試材料在同一引物的RAPD圖譜中的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，這是鑒定黨參真偽的重要標記，可以用于黨參藥材道地性鑒定。另外，不同品種的次譜帶之間存在不同程度的差異，說明不同黨參品系間的遺傳背景也具有一定的多樣性。遺傳相似性及聚類分析表明，甘肅省黨參種質資源間的變異范圍較小，種間遺傳關系較近。這種情況可能是在黨參種植過程中，各個品種之間的地理分布近，并且桔梗科植物多為異花授粉，從而使黨參品種間相互授粉的幾率大大提高，造成種間的遺傳關系較近。本研究中品種DS8和品種DS10分別為選育黨參品種渭黨1號和渭黨2號。品系DS3與品種DS8的親緣關系最近，其相似系數為0.964 9，二者可以進一步與品系DS1聚為一類，這3個材料與品種DS10(渭黨2號)的遺傳距離較遠；品系DS6與其他所有供試材料的親緣關系最遠，可單獨聚為一類。本研究所得結果可為甘肅省黨參種質資源的優化提供部分分子生物學依據。

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