腦缺血再灌注對海馬神經(jīng)MMP-9表達及ERK信號通路的影響

鄧夏珩，高 麗，顧 昊，左國平，沈 偉，郭 軍

(1南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學實驗教學中心，南京210029;2南京醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院)

基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一組活性依賴鈣離子和鋅離子的中性蛋白酶基因家族，在各種組織中廣泛表達，參與降解各種組織細胞外基質(zhì)(ECM)［1］。現(xiàn)已識別20多種蛋白，其中MMP-9是MMPs家族的重要成員，其能破壞ECM降解的正常平衡，導致多種病理過程(如髓鞘脫失、血腦屏障損傷等)發(fā)生，在缺血性組織損傷的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-actived protein kinase，MAPK)家族的首要成員，主要包括ERK1和ERK2，兩者具有相似的結(jié)構和功能。鈣信號能誘導ERK激活且伴隨其自身磷酸化現(xiàn)象［2］，激活的ERK信號通路能上調(diào)多種基因表達。2011年4月，我們對缺血再灌注后海馬腦區(qū)ERK信號通路和MMP-9表達進行了檢測，旨在探討ERK鈣依賴性激活對海馬區(qū)MMP-9表達的影響及其可能的生物學效應。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級成年雄性SD大鼠50只(南京醫(yī)科大學實驗動物中心)，體質(zhì)量250 g左右，室溫下飼養(yǎng);ERK和磷酸化-ERK(p-ERK)抗體(Thr202 /Tyr204，Cell Signaling Technology公司);MMP-9(博奧森公司);N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體偶聯(lián)鈣通道抑制劑氯胺酮(Sigma公司)，ERK抑制劑U0216(Biomol公司)。

1.2 前腦缺血模型制備 取雄性SD大鼠20只隨機分為模型組15只和假手術組5只，模型組采用四動脈阻斷法建立前腦缺血模型［3］:水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后俯臥位固定，暴露第2頸椎，電灼兩側(cè)椎動脈，造成永久性閉塞;腹側(cè)頸正中切口并分離頸總動脈，絲線標記;電灼24 h后動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，使大鼠腦部供血完全阻斷; 10 min后松開動脈夾，再灌注6、12和24 h。該過程要求大鼠在動脈充分阻斷時須滿足下列條件:腦電波完全平坦;瞳孔擴張;無角膜反射;直腸溫度穩(wěn)定在37℃左右。假手術組手術步驟同上，但不阻斷動脈。

1.3 組織樣本制備及蛋白表達檢測 ①組織樣本制備:將上述兩組大鼠斷頭取腦，快速分離海馬，并置于1∶10(W/V)的冰冷勻漿液(Hepes 50，pH 7.4， KCl 100 mmol/L，Na3VO41 mmol/L，NaF 50 mmol/ L，PMSF 1 mmol/L)中，勻漿器高速破碎組織;4℃低溫800 g離心10 min取上清(為胞質(zhì)和胞膜組分)，置－80℃保存。Bradford法測定蛋白含量并將組織樣本調(diào)整為等量蛋白濃度。②ERK、p-ERK、前酶原(pro)-MMP-9蛋白表達檢測:采用電泳與免疫印跡分析法。取等量蛋白加入上樣緩沖液100℃× 5 min制備組織蛋白變性樣本。10%十二烷基磺酸鈉(SDS)—聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(NC)膜，NC膜經(jīng)3%牛血清白蛋白封閉2 h，室溫下一抗孵育4 h或過夜;TBST洗膜3次，加入相應酶標二抗—辣根過氧化物酶(HRP)—偶聯(lián)羊抗兔IgG(1∶10 000)，兔抗鼠IgG (1∶10 000)，室溫反應2 h，TBST洗膜3次，暗室膠片曝光。每組實驗均重復4次以上。取模型組p-ERK、pro-MMP-9蛋白表達最顯著的再灌注時間點用于下述實驗的模型制備。

1.4 氯胺酮及U0216對p-ERK、pro-MMP-9蛋白表達的影響 取30只SD大鼠隨機分為氯胺酮組、U0126組、腹腔溶劑組、腦室溶劑組各5只和假手術組10只，前四組均采用上述方法建立前腦缺血模型，在動脈阻斷前30 min氯胺酮組腹腔注射氯胺酮50 mg/kg;U0126組行乙醚麻醉，固定于腦立體定位儀上，使顱骨保持水平位置，用雙氧水灼燒暴露前囟點，用直徑1.5 mm的鉆頭于前囟后0.8 mm鉆孔，旁開1.5 mm，深3.5 mm，用微量注射器通過單側(cè)腦室注射U0126(0.5 μg/2 μL);腹腔溶劑組和腦室溶劑組分別經(jīng)腹腔和腦室注射等量生理鹽水;假手術組手術步驟同上，但不阻斷動脈。各組處理完畢后均按照1.3方法進行組織樣本制備及蛋白表達檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量數(shù)據(jù)以s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)及Q檢驗(Newman-Keuls法)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血/再灌注不同時間點海馬腦區(qū)ERK、p-ERK和pro-MMP-9蛋白水平 前腦缺血10 min、再灌注后p-ERK和pro-MMP-9蛋白水平持續(xù)上調(diào)(P＜0.05)，且再灌注后24 h最高;而β-actin蛋白水平基本保持穩(wěn)定，見圖1。

圖1 腦缺血誘導海馬區(qū)pro-MMP-9蛋白和p-ERK活性

2.2 氯胺酮及U0216干預后p-ERK、pro-MMP-9蛋白表達變化 氯胺酮組p-ERK和pro-MMP-9蛋白水平顯著高于腹腔溶劑組(P＜0.05)，見圖2(Veh為溶劑、keta為氯胺酮)。U0126組及假手術組pro-MMP-9蛋白表達顯著高于腦室溶劑組(P＜0.05)，見圖3。

圖2 氯胺酮對缺血后海馬區(qū)MMP-9蛋白水平及ERK活性的影響

3 討論

圖3 ERK抑制劑U0126對缺血后海馬區(qū)pro-MMP-9蛋白水平的影響

ERK是細胞內(nèi)一類絲氨酸和(或)蘇氨酸蛋白激酶，能將胞外的各種刺激信號通過一系列級聯(lián)反應傳至核內(nèi)，在核內(nèi)促進多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強其轉(zhuǎn)錄活性。ERK信號通路參與多種生理功能和疾病的發(fā)病機制［4］。MMP-9是MMPs家族中相對分子質(zhì)量最大的酶，越來越多的證據(jù)表明其能通過降解腦血管周圍基膜主要成分Ⅳ、Ⅴ型明膠膠原及層粘連蛋白、纖維連接蛋白［5］，觸發(fā)缺血后繼發(fā)性腦組織損傷。研究顯示，MMP-9定位于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)細胞。腦缺血時MMP-9增加，其中內(nèi)源性MMP-9主要來自星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，外源性MMP-9則來自內(nèi)皮細胞、滲出的中性粒細胞和巨噬細胞。MMP-9活性一旦啟動，即可通過降解細胞外基質(zhì)成分破壞血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)完整性［6，7］。另有研究顯示，MMP-9表達越顯著，BBB通透性越高、炎癥反應越重，可導致腦組織廣泛損傷，使神經(jīng)功能損傷進一步惡化［8］。因此，MMP-9引起的這種腦組織繼發(fā)損傷主要通過兩個途徑實現(xiàn):①腦水腫形成。MMP-9表達或活性升高可通過降解細胞外基質(zhì)使BBB受損，導致腦微血管通透性及BBB通透性增加，毛細血管內(nèi)的水分與血漿蛋白外滲、細胞間隙內(nèi)水分增多，引起血管源性腦組織水腫及神經(jīng)細胞損傷。②誘發(fā)炎癥反應。中性粒細胞、巨噬細胞均需借助于MMP-9游出血管外，BBB破壞則為炎性細胞侵入腦組織提供了通路。中性粒細胞本身可表達MMP-9，通過自身炎性破壞作用直接侵犯神經(jīng)細胞;趨化因子釋放可使中性粒細胞向微血管內(nèi)皮細胞移動和黏附，致使中性粒細胞浸潤，浸潤、聚集的中性粒細胞可釋放氧自由基、溶蛋白酶及細胞激動素等造成組織損傷、壞死，引起腦組織繼發(fā)性損傷。因此，缺血誘導的MMP-9表達上調(diào)與缺血后繼發(fā)性腦損傷有密切聯(lián)系。

鈣依賴性激活的ERK信號通路是缺血后MMP-9功能上調(diào)的重要因素，但ERK上調(diào)MMP-9轉(zhuǎn)錄功能的機制并不清楚。目前有研究表明，ERK信號級聯(lián)能上調(diào)和激活Ets-1編碼的蛋白，而MMP-9基因的啟動子序列上存在4個Ets-1的結(jié)合原件［9］。故ERK通路很可能通過轉(zhuǎn)錄因子Ets-1啟動了MMP-9的轉(zhuǎn)錄表達增加，促進了缺血后腦組織功能障礙。

氯胺酮是一種NMDA受體非競爭性阻斷劑，可用于手術前麻醉誘導和手術中麻醉維持。U0126為ERK抑制劑，可預先抑制ERK通路活化。本研究顯示，前腦缺血10 min、再灌注后 p-ERK和 pro-MMP-9蛋白水平持續(xù)上調(diào)，且24 h最高。提示前腦缺血/再灌注能誘導海馬區(qū)p-ERK活性上調(diào)和pro-MMP-9蛋白水平升高，且兩者可能存在密切聯(lián)系。本研究還顯示，氯胺酮組p-ERK和pro-MMP-9蛋白水平均顯著高于腹腔溶劑組，U0126組MMP-9蛋白表達顯著高于腦室溶劑組。提示腦缺血誘導的ERK激活和MMP-9表達上調(diào)與NMDA受體介導的鈣信號密切相關，激活的 ERK級聯(lián)可能參與了MMP-9表達調(diào)節(jié);缺血誘導的 ERK激活參與了MMP-9基因表達的調(diào)控，是后者蛋白表達增加和功能上調(diào)的重要分子機制。

綜上所述，腦缺血可誘導海馬腦區(qū)pro-MMP-9基因表達和ERK活性上調(diào)，胞內(nèi)NMDA受體介導的鈣信號增強及其激活的ERK級聯(lián)是其重要機制;此為缺血后腦損傷的臨床治療提供了新的思路。

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