靛玉紅對膀胱癌細胞株中Nanog基因表達的影響

曹 婧

鄭州鐵路職業技術學院,河南鄭州 450052

膀胱癌是非常常見的泌尿系統惡性腫瘤，目前我們對膀胱癌采取的主要治療方法是手術切除，術后化療，必要時放療，但療效不很理想。中藥靛玉紅是我國創制的治療慢性粒細胞白血病的有效藥物，它的抗腫瘤作用原理主要為抑制DNA聚合酶，影響DNA的聚合過程，從而使DNA合成受抑制。Nanog基因為一與腫瘤干細胞有關的胚胎干細胞轉錄因子，它能夠在誘導干細胞的分化中發揮功能。靛玉紅對實體瘤及其相關基因表達的作用還有待研究。由此，該實驗將不同濃度的靛玉紅作用于人膀胱癌細胞株，并進一步測定其對Nanog基因的表達抑制情況。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

RPMI1640培養液、胎牛血清、甲基四唑藍、二甲基亞砜（DMSO ）、胰蛋白酶、靛玉紅粉劑、EDTA、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、DEPC、DNA marker、 無水乙醇、RNA提取試劑盒，One-step RTPCR試劑盒。人膀胱癌細胞株。

1.2 實驗分組

對照組：不加靛玉紅；實驗組：加入的靛玉紅最終濃度分別為 1 μmol/L（A 組）、5 μmol/L （B 組）、10 μmol/L（C 組），傳代后培養液內已加入不同濃度的藥物。

1.3 細胞培養與處理

RPMI1640培養液中含有10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、鏈霉素及濃度分別為0、1、5、10μmol/L的靛玉紅，膀胱癌細胞株在上述培養液中按常規方法體外培養。每組共3瓶細胞，其中1瓶用于傳代，2瓶用于收集。持續傳代培養1個月，并收集每組各代細胞，凍存于-40℃冰箱中。

1.4 細胞RNA提取及NanogmRNA的表達檢測

用RNA提取試劑盒提取凍存的各組各代細胞RNA，將RNA用one-step RT-PCR試劑盒逆轉錄為cDNA再進行PCR擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并分析其與內參的灰度比。Nanog 上游引物為 5’-ATG CCT CAC ACG GAG ACTGT-3’，下游 5’-AGG GCT GTC CTG AAT AAG CA-3’，片段長度為66bp；內參 β-actin上游引物 5’-CAT CCT GCG GCT GGA CCT-3’，下游 5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，片段長度為480bp。

1.5 統計方法

采用統計學軟件SPSS13.0進行單因素方差分析，數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較用 t檢驗。

2 結果

結果表明，各實驗組細胞對Nanog基因mRNA的表達隨靛玉紅作用時間的延長逐漸下降。見圖1。

選取靛玉紅作用9 d為同一觀察時相。即對照組和A組傳代至第三代細胞，B組為第二代，C組仍為第一代細胞。結果顯示，1、5、10μmol/L靛玉紅均可抑制Nanog基因mRNA的表達與對照組相比差異有統計學意義（P<0.05），且抑制作用隨濃度增加逐漸增強，4組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同濃度靛玉紅對Nanog mRNA表達影響（±s）

表1 不同濃度靛玉紅對Nanog mRNA表達影響（±s）

注：各組與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）,且4組間表達差異有統計學意義（P<0.05）。

藥物濃度（μmol/L） Nanog與內參β-actin灰度比0151 0 0.581±0.017 0.463±0.018 0.212±0.035 0.158±0.041

3 討論

我國膀胱癌發病率居泌尿系統腫瘤第1位，其中90%以上為移行細胞癌。由于其術后輔助治療療效不甚理想，尋找新的、有效的抗膀胱癌細胞增殖的藥物已成為當務之急。中藥在抗腫瘤方面愈發顯出優勢，從中藥中尋找新的抗腫瘤藥物已成為當前的研究熱點。靛玉紅是從傳統中藥青黛中提取的有效成分，對慢性粒細胞白血病有明顯療效。其作用原理主要為抑制DNA聚合酶，影響DNA聚合過程，從而使DNA合成受抑制。除此之外，其抗癌作用還可能與提高機體免疫功能有關。目前靛玉紅主要用于對慢性粒細胞白血病的治療，對實體瘤細胞的抑制作用研究進行得較少。

腫瘤干細胞研究目前成為腫瘤細胞生物學的一個熱門領域，腫瘤干細胞與腫瘤的發生、進展、復發有密切關系[1]。膀胱癌的復發率較高，與腫瘤干細胞無法被化療藥物殺死，在體內長期存在也有關。探討干細胞的發生發展及與其有關的基因并尋找通過此途徑發揮抗癌作用的藥物，已成為腫瘤治療的新途徑，值得進行深入研究。Nanog是新發現的一種轉錄因子，在保持胚胎干細胞多能性的機制中有重要作用，是具有同源結構域的基因。Nanog在胚胎干細胞即ES細胞有很強的表達，另外，它在胚胎生殖細胞和胚胎癌細胞中也都有表達。而目前對Nanog的表達調控，尚有待進一步研究。該實驗結果表明，Nanog的表達水平在每個實驗組內隨時間下降。作用時間相同時，Nanog與內參的灰度比隨藥物濃度上升而逐漸下降。證明靛玉紅能夠抑制膀胱癌細胞株中Nanog基因的表達，且抑制作用隨時間延長和藥物濃度增加而增強。這對進一步發掘其抗腫瘤作用機制，開辟其應用的新途徑提供了實驗和理論依據。

[1]KurisakiA，Hamazaki TS.Chromatin-related proteins in pluripotentmouse embryonic stem cells are downregulated after removal of leukemia inhibitory factor[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，335(3):667-675.