葛根異黃酮在實驗性大鼠小腸吸收的藥動學研究

范 昕 北京市房山區良鄉醫院 （北京 102401）

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）ohwi的干燥根，主要功效成分為異黃酮，具有擴張血管、改善心肌的氧代謝、改善微循環、降低血管阻力等作用，廣泛應用于心腦血管的防治。目前，關于葛根的研究主要是局限在葛根中幾個異黃酮的藥動學，而對葛根總黃酮提取物的藥動學研究較少。本實驗結合離體和體內實驗預測藥物的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與儀器 葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素為本實驗室自制，經HPLC法測定含量均在98%以上。葛根（產地：四川；批號100623），經本院周偉副教授鑒定為正品。葛根總黃酮提取物 （本院化學室，含葛根素44.57%，大豆苷12.53%，大豆苷元3.87%，染料木素2.74%）。Agilent1100高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器，HP1100色譜工作站。電子分析天平（Sartorius BS124S），移液槍（Gilson），高速離心機 （塞維斯科技有限公司）。HSE－12A 固相萃取儀，Agela Cleanert ODS－Cl8SPE柱 （100mg，1mL）（北京成萌偉業科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體重200±20g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 葛根總黃酮的提取方法 將5kg葛根藥材粉碎，70%乙醇（5倍量）回流提取2h，重復2次，合并提取液，減壓回收至5000mL，用95%的乙醇調乙醇濃度至70%，抽濾，回收乙醇，減壓干燥得樣品。

1.2.2 臺氏液的配制 密稱取 NaCl 80g，KCl 0.28g，NaHCO31.0g，NaH2PO40.05g，MgCl20.1g，溶于500mL蒸餾水中，CaCl20.2g溶于500mL蒸餾水中，用前將CaCl2與前者混合，再加入葡萄糖 10g，即得［1］。

1.2.3 色譜方法 色譜柱：Diamonsil XDB－C18色譜柱，（250mm×4.6mm，5μm），預柱為Diamonsil XDB－C18柱 （12.5 mm×4.6mm，5μm）。梯度洗脫：A （乙腈），B（0.5%乙酸水），0～30min （11：89），30～60min （11：89→50：50），60～75min（50：50→40：60）。柱溫30℃，檢測波長250nm，流速1.0mL／min，進樣量20μL。

1.2.4 擴散池法 大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉脫頸猝死，打開腹腔，取出小腸，置臺式液中，剪取3～4cm腸段，固定于擴散池上。黏膜側向上，黏膜側加入含樣品的臺式液，漿膜側加入空白臺式液。實驗在37℃水浴進行，臺式液通氣體（95%O2、5%CO2）。

1.2.5 擴散池給藥方案 取葛根總黃酮提取物三份，溶解于1ml的臺式液中 （以葛根素為準，分別含有葛根素20、50、100μg／mL）作為供試液。將配好的供試液加到黏膜側，按照1.2.4方法操作，2h后收集雙側的培養基，20℃保存。

1.2.6 大鼠體內試驗給藥方案與血樣采集 大鼠禁食不禁水12h，葛根總黃酮提取液灌胃，按200mg／kg給藥，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24h眼眶后靜脈叢取血0.5mL。4000r／min離心5min分離血漿，20℃保存。

1.2.7 樣品處理 將SPE柱用甲醇和水活化。取待測樣品0.1mL移入已活化的SPE柱，減壓使其恒速通過SPE柱。用水2mL清洗，抽干，再用甲醇1.5mL洗脫，收集洗脫液，洗脫液50℃水浴中N2吹干。用0.1mL流動相復溶，微孔濾膜過濾，進樣20μL，HPLC分析。

1.2.8 方法學考察 分別取葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素對照品適量，等比稀釋成一系列不同濃度的供試品溶液。分別取不同濃度的對照品溶液0.1mL兩份，加入空白臺式液和大鼠空白血漿各0.1mL，按1.2.6方法處理，測得峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸。同法配制低、中、高3個濃度的混合標準品溶液，按1.2.6方法操作，計算回收率和日內、日間精密度。

1.2.9 數據分析 擴散池結果用表觀滲透系數（Papp）和表觀滲透率（PDR）表示。大鼠體內的藥時數據采用3p87軟件進行模型擬合，以AIC值和F檢驗結果確定最佳房室模型，并計算各藥動學參數。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 配制含葛根素濃度為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μg／mL的混合標準品溶液，按1.2.3色譜條件測定。結果表明四個被測成分在各自的標準曲線范圍內線性關系良好，回歸方程分別為葛根素 Y＝72120X－68.96（r＝0.9999），大豆苷＝57417X－27.407（r＝0.9999），大豆苷元 Y＝51675X－6.1665（r＝0.9998），染料木素 Y＝49673X－8.1469（r＝0.9998）；葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的線性范圍分別為1.82～90μg／mL，0.43～20μg／mL，0.01～5μg／mL，0.01～5μg／mL。葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率在96.57%－104.87%之間，精密度實驗結果RSD在0.68%－1.27%之間，標準品在冷凍解凍以及室溫8h內穩定性實驗結果RSD＜2%。在葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素保留時間附近無基質干擾。本實驗方法準確，可行

2.2 藥物的吸收研究

2.2.1 腸吸收實驗 擴散池實驗結果見表1。葛根素為濃度依賴性吸收，無明顯外排；大豆苷吸收和外排差；大豆苷元、染料木素吸收與給藥濃度成正比，且染料木素外排作用強于大豆苷元。

表1 不同質量濃度的葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的腸吸收量（n＝3）

圖1 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的平均血藥濃度－時間曲線。

表2 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的藥代動力學參數值（n＝6，）

表2 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的藥代動力學參數值（n＝6，）

項目 葛根素 大豆苷 大豆苷元 染料木素α 0.71±0.050.33±0.070.39±0.110.78±0.12 β 0.05±0.010.13±0.020.03±0.010.04±0.01 Ka 1.96±0.451.93±0.251.02±0.321.90±0.32 t1／2α 0.98±0.122.08±0.341.78±0.540.88±0.21 t1／2β 12.33±0.236.12±0.6520.99±3.2115.92±2.13 AUC 194.07±4.3254.84±1.23627.32±9.31363.1±3.32 K210.12±0.020.13±0.040.09±0.020.10±0.04 K100.32±0.120.28±0.090.14±0.070.34±0.05 K120.31±0.080.03±0.010.19±0.060.39±0.23 Vc 2.69±0.430.31±0.051.36±0.342.61±0.98 Cl 0.26±0.090.91±0.140.08±0.010.14±0.02

2.2.2 大鼠吸收的藥代動力學研究 大鼠灌胃給藥后測得葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的藥時曲線見圖1。用3p87軟件進行藥代動力學模型擬合，除大豆苷外，葛根素、大豆苷元和染料木素在大鼠體內的動力學行為均符合二房室開放模型。葛根素吸收速度最快，大豆苷消除最快，大豆苷元給藥24h后仍可檢測到。主要藥代動力學參數見表2。

3 討 論

3.1 由表1可知小腸對葛根異黃酮有外排作用，結果與文獻［2］報道一致。本實驗通過檢測4種異黃酮的透過率，以考察不同濃度葛根異黃酮提取物在小腸壁的吸收情況，結果顯示與王睿銳等的研究結果相符［3］。大豆苷的吸收與濃度無關的原因可能是小腸的首過效應所致［4］，大豆苷屬于氧苷異黃酮，而小腸壁上存在大量Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶，所以大豆苷在吸收過程中極易被代謝為大豆苷元，導致大豆苷元高劑量組的吸收率比低劑量組高。

3.2 染料木素在體內的行為與葛根素相似，本實驗說明染料木素不但可以促進葛根素的吸收，同樣也可以因整體給藥提高自身的吸收。大豆苷和大豆苷元的吸收速率較葛根素和染料木素慢，說明大豆苷和大豆苷元在小腸的透過率較低，也可能有載體蛋白的抑制作用以及小腸對大豆苷的首過效應。但是大豆苷元的消除半衰期大于大豆苷，而且大豆苷的Cl最大，說明大豆苷元比大豆苷在體內的保留時間長，生物利用度大，在圖1中也可以看出大豆苷元的達峰時間在大豆苷的后面，而且葛根總黃酮中大豆苷元的含量沒有圖1中大豆苷元的達峰濃度那么高，大豆苷元更多的是由大豆苷消除后代謝生成的。本實驗通過葛根總黃酮給藥，目的是尋找能夠提高葛根異黃酮生物利用度的方法，與仇峰［5］研究了大豆苷元及其前體藥物在體內的藥代動力學的結果相得益彰，而對于本實驗，大豆苷即是大豆苷元的前藥。大豆苷元有心腦血管系統作用、雌激素樣作用和杭癌及誘導癌細胞的分化等作用，大豆苷元生物利用度的提高有利于其藥效作用的發揮。

3.3 本實驗就葛根總黃酮的透過率和口服后的體內吸收情況進行了研究，研究結果與以往報道的結果進行了比較，初步推斷整體給藥的效果比單體給藥的效果好，但是本實驗僅僅監測了葛根總黃酮中的4個成分，不能完全代表葛根中的藥效成分，所以需要進一步研究。

［1］龔慕辛，王雅璕，宋亞芳，等.外翻腸囊法快速發現吳茱萸湯吸收成分群的研究 ［J］.中國中藥雜志，2010，35（11）：1399－1404.

［2］崔升淼，趙春順，何仲貴.大鼠腸管外翻模型對葛根素吸收機制的研究 ［J］.時珍國醫國藥，2008，19（7）：1715－1716.

［3］王睿銳，沈 琦.黃豆苷元、染料木素對葛根素小腸吸收影響 ［J］.中成藥，2011，33（8）：1323－1326.

［4］鄧婧婷，莊笑梅，李 樺.小腸首過代謝的研究進展［J］.中草藥.2010，37（4）：269－275.

［5］仇 峰.大豆苷元及其前體藥物的藥物動力學研究［J］.中草藥2005，19－21.