來源于青霉XMZ-9兩個低溫脂肪酶的基因克隆、原核表達與性質測定

鄭小梅，伍寧豐，范云六

中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081

脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 是一類重要的工業用酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1]。與動、植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有底物廣譜性，并且具有更廣的pH與溫度作用范圍，更適合于工業化大生產和獲得高純度樣品，從而使微生物脂肪酶成為工業用脂肪酶的重要來源[2]。

低溫脂肪酶在低溫下仍具有較高活性，使其成為近年來研究的熱點[3]。這類酶進化出了更高的結構柔韌性，尤其是在活性位點附近，往往使其具有較低的活化能，從而酶在低溫環境下更容易發揮催化作用，提高對底物的利用率[4]。此外，低溫脂肪酶的結構柔韌性使其在高溫條件下的熱穩定性相對于中溫酶要差一些[3]。但正是這些特點使低溫脂肪酶在食品添加劑、洗滌添加劑及有機合成等產業中具有非常獨特的應用前景[5-7]。在食品行業，可作為低溫添加劑改善食品的風味；在洗滌行業，可在冷水中仍具有較好的去油污的效果等等[8-10]。低溫脂肪酶往往存在于那些常年生活在如冰川、深海、南極甚至冰箱等低溫環境中的低溫微生物中[10-14]。目前，低溫脂肪酶多來源于細菌與酵母，來源于真菌的還非常少見[3]。

本研究從冰川土樣中分離獲得一株具有較高脂肪酶酶活的青霉菌Penicillium sp. XMZ-9。利用TAIL-PCR等方法從Penicillium sp. XMZ-9基因組中克隆到 2個完整的脂肪酶相關基因：LipA與LipB；并將兩基因的cDNA序列在大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3) 中得到了高效表達。經體外復性或親和純化等方法純化后，對2個重組酶進行溫度適應性測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

青霉菌Penicillium sp. XMZ-9由本實驗室從冰川土壤中分離并鑒定；E. coli Top10、E. coli BL21 (DE3) 與表達質粒 pET30a (+) 均由本實驗室保存；克隆質粒pEASY-T3載體購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 工具酶與試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、染色體步移試劑盒均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒與RNA prep pure植物 (真菌) 總RNA提取試劑盒購自天根生物技術公司；蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司；Ni-NTA樹脂購自QIAGEN公司；丙烯酰胺、N, N￠-亞甲叉丙烯酰胺、IPTG購自Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨購自 Oxford公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 產脂肪酶菌株的篩選

我們從新疆冰川低溫土樣中進行了低溫微生物的富集培養與分離鑒定。用富集培養基(1% (V/V) 橄欖油，0.5% (W/V) 蛋白胨與0.5% (W/V) NaCl) 對土樣在25 ℃下低溫富集培養后，將過夜培養物稀釋后涂布于含有 1% (V/V) 橄欖油的瓊脂平板中。將劃線后的單菌落在含有1% (V/V) 三丁酸甘油酯與維多利亞藍的脂肪酶篩選平板上進行產脂肪酶活性的定性檢測。根據降解透明圈的大小，我們選取了產脂肪酶真菌XMZ-9進行后續研究。通過菌落形態與18S rDNA的分子鑒定來鑒定真菌XMZ-9的種屬分類。

1.2.2 青霉菌基因組DNA與RNA的提取

青霉菌基因組 DNA的提取按照文獻[15]進行；其總RNA的提取則按照RNA prep pure植物(真菌) 總RNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.3 青霉菌脂肪酶基因及cDNA序列的克隆

從 GenBank數據庫中下載不同真菌脂肪酶的蛋白序列，使用 ClustalW 軟件[16]進行多序列比對分析確定真菌脂肪酶的保守區 (FHGGG與GFSAGG)。依據所得的保守區與青霉菌密碼子的偏愛性設計簡并引物lipPF與lipPR (表1)。以Penicillium sp. XMZ-9基因組DNA為模板，利用簡并引物進行降落PCR，擴增兩保守區之間的基因序列。降落PCR的條件為：首先94 ℃預變性5 min；然后20個降落循環：94 ℃ 變性30 s，退火溫度從65℃開始，此后每個循環降落0.5 ℃，至55℃，72 ℃延伸30 s；再次20個循環：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產物回收后連接到pEASY-T3載體進行序列測定與分析。

為獲得完整的基因全長，以已知序列為模板向上下游方向分別設計 3個嵌套的特異引物(表 1)，然后用染色體步移試劑盒進行染色體步移。針對 LipA基因的上游序列克隆所用引物為lipAFsp1、lipAFsp2、lipAFsp3；針對LipA基因的上游序列克隆所用引物為 lipARsp1、lipARsp2、lipARsp3；針對LipB基因的上游序列克隆所用引物為 lipBFsp1、lipBFsp2、lipBFsp3；針對 LipB基因的上游序列克隆所用引物為 lipBRsp1、

lipBRsp2、lipBRsp3。將所得的各個基因的上下游片段與已知序列用 Vector NTI Suite 9.0 (InforMax, Gaithersburg, MD, USA) 軟件進行拼接。全基因序列在 NCBI網站利用 BLAST X (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 進行相似性比對研究。用DS Gene軟件預測完整的開放閱讀框，并利用 Gene Finder軟件 (http://www. bioscience.org/urllists/genefind.html) 分析基因中的外顯子與內含子。

表1 基因克隆與表達所用引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression in this study

以5 μg總RNA為模板，用反轉錄酶Rever Tra Ace和引物Oligo-dT進行反轉錄反應，獲得cDNA的第一鏈。以lipAFm (含EcoRⅠ酶切位點)與 lipARm (含 NotⅠ酶切位點) 及 lipBFm (含SacⅠ酶切位點) 與lipBRm (含XhoⅠ酶切位點)為引物進行PCR，擴增兩基因帶酶切位點修飾的全長cDNA。PCR產物回收后連接到pEASY-T3載體進行序列測定與分析。

1.2.4 重組表達載體的構建與誘導表達

用相應的限制酶酶切測序正確的pEASY-T3重組質粒，將目的基因的酶切片段與同樣酶切處理的表達質粒pET30a (+) 進行連接。將驗證正確的重組表達質粒pET-lipA、pET-lipB及空表達質粒pET30a (+) 分別轉化E. coli BL21 (DE3)。將轉化菌株過夜活化后，以1%的接種量轉接至50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，振蕩培養約2 h，當OD600達到0.6后，加入20 μL l mol/L IPTG在16 ℃下進行低溫過夜誘導表達。將50 mL菌液高速離心棄上清，菌體用5 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液重懸，加入PMSF (終濃度為0.1 mmol/L)，進行超聲波破碎細胞，15 000 r/min離心20 min，破碎后的上清液為破碎上清即可溶性的重組酶液，沉淀為包涵體的粗提物。分別加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴 5 min，進行濃度為 12% SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 重組蛋白的親和純化

首先用 10 mL平衡緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，10 %甘油與0.5 mol/L NaCl)平衡親和層析樹脂Ni-NTA柱，然后加入破碎上清的樣品，再分別加入10 mL 含有0、20、100、200 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫并收集相應洗脫液。取 50 μL穿透峰及各洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。收集純度較好的洗脫液在50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中進行過夜透析，除去洗脫液中的咪唑。

1.2.6 包涵體蛋白的變性與復性

用1 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 緩沖液洗滌包涵體的粗提物2次，然后分別用1 mL 2 mol/L與4 mol/L尿素洗滌沉淀，除掉可能的雜蛋白，最后將沉淀重溶于500 μL 8 mol/L 尿素變性液，37 ℃過夜孵育使沉淀充分溶解。變性后的蛋白用復性緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，10%甘油與1%甘氨酸) 進行不同倍數稀釋，4 ℃孵育12 h，進行稀釋復性并摸索合適的稀釋倍數。

1.2.7 重組脂肪酶的活性測定

脂肪酶活性檢測采用分光光度計比色法檢測對硝基酚的生成量[17]。底物母液為500 μmol/L對硝基辛酸酯的乙醇溶液。標準的反應條件為100 μL的底物母液溶于 1.8 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中，35 ℃預熱5 min后再加入100 μL檢測酶液，準確反應10 min，然后加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應，再加入0.5 mL 10%碳酸鈉溶液顯色。高速離心去除沉淀后，410 nm下測定脂肪酶酶催化產生的對硝基酚的光吸收值。一個脂肪酶酶活單位 (1 U) 定義為在pH 8.0，35 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol/L對硝基酚所需的酶量。對照反應為在相同條件下加入等量已滅活的酶液。每個反應均做3個平行樣，取平均值作為最終酶活值。

1.2.8 脂肪酶溫度適應性的測定

在50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 緩沖液和不同溫度 (0~60 ℃) 下測定脂肪酶活性，根據相對酶活值來確定最適溫度。將酶液先在40 ℃、50 ℃與60 ℃下處理不同的時間梯度2、5、10、20、40、60、80、100 min，再測定殘留酶活值以檢測酶蛋白的溫度穩定性。

2 結果

2.1 產脂肪酶菌株的篩選

通過富集培養從新疆冰川低溫土樣中分離到5株低溫真菌。根據降解透明圈的大小，選取了產脂肪酶活性最高的真菌XMZ-9進行后續研究。菌落形態與 18S rDNA的分子鑒定表明XMZ-9為青霉屬 Penicillium。其18S rDNA在GenBank數據庫的登錄號為FJ973461。

2.2 青霉菌脂肪酶基因及 cDNA序列的克隆與分析

以Penicillium sp. XMZ-9基因組DNA為模板，利用簡并引物 (lipPF與lipPR) 降落PCR，擴增到一個大小約為220 bp的片段。PCR產物經序列測定與比對分析發現其包括2段相似性為60%且大小相差6 bp的基因片段。用BLAST X進行序列比對表明其中一個基因片段與來源于棒曲霉Aspergillus clavatus NRRL 1的脂肪酶相似性為79%；另一基因片段與來源于費氏新薩托Neosartorya fischeri NRRL 181的酯酶相似性為86%。

根據已獲得的兩段基因片段設計了向上、下游方向的特異引物 (表1)，利用染色體步移試劑盒擴增獲得了兩基因片段的側翼序列 (圖1)。經基因拼接與序列分析表明已獲得2個編碼脂肪酶的完整基因，分別記為 LipA與 LipB (GenBank數據庫的登錄號分別為FJ973462與FJ973463)。隨后，利用RT-PCR從Penicillium sp. XMZ-9總 RNA中擴增到2個基因的全長cDNA序列。

脂肪酶結構基因LipA全長1 014 bp，無內含子，編碼337個氨基酸和1個終止密碼子，成熟蛋白理論分子量38.39 kDa。蛋白序列比對結果表明與黑曲霉Aspergillus niger strain CBS 513.8脂肪酶LipP (GenBank Accession No. A2Q8U6)的一致性最高為68%。用SignalP 3.0 Server信號肽預測表明其1~22 aa為信號肽。而脂肪酶結構基因LipB全長1 232 bp，cDNA長1 122 bp，含有2個內含子，分別為位于+538~+598 (61 bp)的內含子序列與位于+917~+966 (49 bp) 的內含子序列。該基因編碼373個氨基酸和1個終止密碼子，成熟蛋白理論分子量41.63 kDa。蛋白序列比對結果表明與N. fischeri NRRL 181的酯酶(GenBank Accession No. A1DL68) 的一致性最高為75%。用SignalP 3.0 Server信號肽預測表明其無信號肽。

2.3 青霉菌脂肪酶的誘導表達

以cDNA為模板，以lipAFm與lipARm為引物進行PCR擴增到目的基因LipA；以lipBFm與 lipBRm為引物進行 PCR擴增到目的基因LipB。測序無誤后，分別克隆至表達載體pET30a (+)，構建表達重組質粒 pET-lipA與pET-lipB。在E. coli BL21 (DE3) 中的誘導表達發現，經IPTG誘導后，基因lipA基本表達為不可溶的包涵體 (40 kDa，圖2，Lane 2)；而基因lipB則大部分表達為可溶的蛋白形式 (43 kDa，圖2，Lane 5)。

2.4 活性重組酶LipA與LipB的獲得

由于重組酶LipA大部分表達為不可溶的包涵體，因此采用了尿素變性與稀釋復性的方法來獲得其活性脂肪酶。經 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、2 mol/L與4 mol/L尿素洗滌沉淀去除雜蛋白后，用8 mol/L 尿素可將包涵體完全變性。變性后的樣品可達到電泳純的純度，如圖3A所示。通過不同的稀釋倍數進行稀釋復性發現稀釋50倍時，其酶活可達到15.72 U/mL。

圖1 青霉菌脂肪酶染色體步移電泳圖Fig. 1 Genome walking results of Penicillium lipases. (A) genome walking results of LipA. (B) genome walking results of LipB. M: 1 kb standard protein molecular weight markers; 1,3,5,7: the 2nd PCR results in genome walking processes; 2,4,6,8: the 3rd PCR results in genome walking processes; 1,2,5,6: the PCR results using No.2 AD primer; 3,4,7,8: the PCR results using No.4 AD primer.

圖2 SDS-PAGE電泳檢測重組青霉菌脂肪酶LipA與LipB在大腸桿菌中的表達Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant LipA and LipB expressed in E. coli. M: standard protein molecular weight markers; 1,2: lysate supernatant (1) and cell pellet (2) of transformed bacteria harboring pET-lipA; 3,4: lysate supernatant (3) and cell pellet (4) of transformed bacteria harbouring empty vector pET30a(+); 5,6: lysate supernatant (5) and cell pellet (6) of transformed bacteria harboring pET-lipB.

相對而言，重組酶LipB大部分表達為可溶的形式，利用Qiagen的His-標簽蛋白親合層析柱進行了純化，含有100 mmol/L與200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫效果較好，透析濃縮后，可達到電泳純，如圖3B所示；純化的LipB酶活可達到7.34 U/mL。

2.5 重組脂肪酶酶LipA與LipB的溫度適應性

圖3 純化的重組青霉菌脂肪酶LipA與LipB SDS- PAGE電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant LipA and LipB. (A) the recombinant LipA protein, expressed in E. coli and dissolved in 8 mol/L urea, was analyzed by SDS-PAGE. M: standard protein molecular-weight markers; 1: purified inclusion body containing LipA; 2: cell pellet of transformed bacteria harboring pET-lipA. (B) the recombinant LipB protein, recovered at various points in the purification process, was analyzed by SDS-PAGE. M: standard protein molecular weight markers; 1: lysate supernatant of transformed bacteria harboring pET-lipB; 2: purified LipB after dialysis and concentration.

重組酶LipA與LipB最適溫度的酶活性測定結果表明，兩者水解對硝基辛酸酯的最適反應溫度分別為30 ℃與40 ℃ (圖4)。LipA在溫度低于30 ℃時，隨著溫度升高酶的活性逐步上升，在10 ℃與 20 ℃時相對酶活性達到 28.18%與60.11%；高于30 ℃酶活力下降，到60 ℃只有最大活力的37.23%；在20 ℃到50 ℃的條件下仍具有50%以上的酶活。LipB在溫度低于40 ℃時，隨著溫度升高酶的活性逐步上升，在10 ℃與 20 ℃時相對酶活性可分別達到 31.27%與56.99%；高于40 ℃酶活力迅速下降，到60 ℃時只有最大活力的18.91%；在20 ℃到50 ℃的條件也保持有50%以上的酶活。

熱穩定性實驗中，酶活性測定結果表明，重組酶LipA與LipB的熱穩定性都不是很好，但相對而言，LipA的熱穩定性略好于LipB (圖5)。在低溫條件40 ℃下，LipA與LipB 保溫100 min后相對酶活仍具有85.26%與79.03%。但隨溫度的提高，脂肪酶的活性下降較為明顯。在50 ℃下，LipA與LipB 保溫100 min后相對酶活分別只具有30.85%與23.57%。在60 ℃下，LipA與 LipB 保溫 10 min后相對酶活明顯下降至23.32%與31.55%。保溫100 min后相對酶活分別只具有11.66%與6.09%。

圖5 重組脂肪酶LipA與LipB酶反應熱穩定性Fig. 5 Thermostability of purified LipA (filled) and LipB (empty). The recombinant LipA and LipB were incubated in 50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 8.0) at 40 °C (square), 50 °C (triangle), and 60 °C (downwardpointing triangle) for the indicated periods of time, and enzymatic activity was measured using p-NP decanoate as substrate.

3 討論

圖4 重組脂肪酶LipA與LipB酶反應最適溫度Fig. 4 Influence of temperature on lipase activity. Activity of LipA (filled square) and LipB (filled triangle) was assayed at pH 8.0 and a range of different temperatures using p-NP decanoate as substrate.

低溫微生物主要分布于冰川、高山及南極等終年保持低溫的環境中。產脂肪酶低溫微生物多為細菌與酵母，產脂肪酶低溫真菌中還非常少見[2]。早在1961年，Alford與Pierce[18]就從冷凍的食物樣品中分離到一些嗜冷真菌如解脂假絲酵母 Candida lipolytica、白地霉 Geotrichum candidum與婁地青霉Pencillium roqueforti能產生低溫脂肪酶，但未進行深入的研究。Mayordomo等[19]從構巢曲霉Aspergillus nidulans WG312中純化了一低溫脂肪酶，其最適溫度為40 ℃，但其產量有限，限制了其應用，此外并未進行基因克隆與表達研究。本文從冰川土樣中分離得到菌株Penicillium sp. XMZ-9。利用低溫微生物可特異性地表達分泌低溫酶的特性[20]，在25 ℃下富集培養，并通過三丁酸甘油酯與維多利亞藍的篩選平板上的降解圈篩選出了具有較高脂肪水解活性的Penicillium sp. XMZ-9。

從自然界中篩選得到的脂肪酶產生菌中，脂肪酶基因受到較為嚴謹的調控，因此脂肪酶的生產量較少，即使通過誘變發酵后也難以滿足市場的需求[21]。利用基因工程技術，從脂肪酶產生菌中克隆脂肪酶基因并進行異源或同源重組表達是有效的解決辦法[21]。本文中通過對已有真菌脂肪酶的多序列比對，發現了2個真菌源脂肪酶的保守區：氧陰離子洞 FHGGG與催化活性位點G(F/S)S(A/V)GG。設計簡并引物，利用降落PCR，直接從基因組中克隆到了2個相似性較低的脂肪酶基因片段。隨后通過染色體步移的方法成功克隆了2個脂肪酶基因。由此可見，采用這一策略是行之有效的獲得完整未知基因方法[22]。

真菌脂肪酶基因中內含子的數目各不相同，對于有內含子的脂肪酶基因的內含子的結構和剪接位置與已確定的絲狀真菌都非常類似[15]，例如長度一般小于 100 bp，5￠-剪接位點為GTRNGT，3￠-剪接位點為YAG (R：嘌呤堿核苷酸，Y：嘧啶堿核苷酸，N：任意核苷酸)。Penicillium sp. XMZ-9的基因lipA沒有內含子，但lipB中存在2個內含子，分別為61 bp與49 bp的內含子序列，在其末端都具有內含子典型的剪接位點序列5￠-GTGAGT-3￠與5￠-TAG-3￠。

pET表達系統是應用最為廣泛的大腸桿菌表達系統，但其表達產物往往形成無活性的包涵體，如來源于黑曲霉 A. niger F044的脂肪酶Anl[23]。本文中來源于Penicillium sp. XMZ-9的2個脂肪酶在 pET表達系統中，一個表達為包涵體，一個則正常表達為可溶的蛋白，可推斷是否表達為包涵體可能更取決于目的基因的本身。

低溫脂肪酶是指最適催化反應溫度在30 ℃左右，在低溫下仍具有一定活性的脂肪酶[20]。經最適溫度與溫度穩定性測定，發現重組脂肪酶LipA與LipB的反應最適溫度在30℃~40 ℃之間，在20 ℃時相對酶活均超過50%，并且在高溫下溫度穩定性不好，這都與低溫脂肪酶的基本特征相一致。可初步判定得到的2個基因為低溫脂肪酶基因，這也是與菌株的原始生長環境相一致。

低溫脂肪酶以其獨特性質具有廣闊的應用前景。本文從同一青霉菌中克隆獲得2個相似性較低的脂肪酶基因，并在大腸桿菌中進行了異源表達與純化。溫度適應性測定表明2個重組酶為低溫脂肪酶。本實驗室也繼續探索采用酵母或黑曲霉表達系統來進行分泌表達，期望獲得更好的低溫脂肪酶表達工程菌，為下一步的開發應用奠定基礎。

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