臨床常見的革蘭陰性桿菌耐藥情況及其aac（6’）－Ib－cr基因檢測結果分析

吳玉紅，白麗霞，楊 虹

（北京大學深圳醫院 檢驗科，廣東 深圳 518036）

隨著喹諾酮類和氨基糖甙類兩種藥物在臨床上的廣泛應用，兩者的耐藥性也在逐漸上升。細菌對喹諾酮類藥物的耐藥研究，國內外早期的研究主要集中于染色體介導［1］的喹諾酮耐藥機制，而近年來，質粒介導的喹諾酮類耐藥備受關注，尤其是最近發現的能使氨基糖甙類藥物和氟喹諾酮類藥物同時失活的氨基糖甙乙酰轉移酶的變異基因aac（6’）－Ibcr，該基因編碼的滅活酶可使環丙沙星及諾氟沙星中的氨基氮發生乙酰化，從而使其抗菌活性下降。研究顯示該基因可使細菌對環丙沙星及諾氟沙星的最小抑菌濃度（MIC值）上升4倍［2］。本研究了解我院2011年臨床常見的革蘭陰性桿菌的耐藥狀況及其質粒介導的能使喹諾酮類和氨基糖甙類藥物同時耐藥的基因aac（6’）－Ib－cr的流行分布狀況，從而比較分析aac（6’）－Ib－cr基因在不同菌種中的分布差異。目前國內對aac（6’）－Ib－cr基因研究甚少，而且尚無該基因在不同菌屬間分布差異的相關研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究收集2010年從臨床分離的299株非重復的臨床常見的革蘭陰性桿菌，其中53株鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanni，Aba）、66株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pae）、83株大腸埃希菌（Escherichia coli，Eco）和97株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）。

1.1.2 主要試劑 培養基為分離培養用培養基（Columbia基礎＋5 ml／dl脫脂羊血）；細菌鑒定和藥敏試劑為MicroScan；Taq DNA Polymerase聚合酶及PCR相關材料購自Fermentas生物工程公司；引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司（Invitrogen Trading（shanghai）Co，Ltd）合成。

1.1.3 主要儀器 全自動細菌鑒定及藥敏分析儀為美國 MicroScan Walk Away 40；BIO－RAD（美國）公司生產的C1000TMThermalCycler PCR儀；Eppendorf（德國）生產的Centrifuge 5417R臺式冷凍離心機；BIO－RAD（美國）生產的 Power Pac Basic PowePac HC電泳儀；BIO－RAD（美國）生產的 Gel Doc XR＋凝膠成像及分析系統。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及其MIC值的測定：用全自動細菌鑒定及藥敏分析儀MicroScan Walk Away 40進行細菌鑒定和藥敏試驗（MIC值），并嚴格按照CLSI標準判斷藥敏結果。質控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2.2 PCR模板的提取：煮沸法提取細菌基因組DNA。將細菌接種于LB平板上，37℃培養箱培養過夜，次日選單個菌落于LB平板分純，37℃培養。第三天挑取數個菌落入盛有180μl的雙蒸水（DDH2O）EP管中，煮沸10 min，13 000 r／min離心3 min。取上清液即細菌DNA模板于EP管，在－20℃保存備用。

1.2.3 基因aac（6’）－Ib的 PCR 篩選及aac（6’）－Ib－cr的確定：采用PCR檢測所有菌株的質粒介導耐藥基因aac（6’）－Ib；并以內切酶BtsCI酶切消化aac（6’）－Ib的PCR陽性產物以確定aac（6’）－Ib－cr。

aac（6’）－Ib引物設計參照文獻［3］，上游引物5’－TTGCGATGCTCTATGAGT－GGCTA－3’和 下 游引物5’－CTCGAATGCCTGGCGTGTTT－3’，產物482 bp。反應條件：94℃變性45 S，55℃退火45 S，72℃延伸45 S，34個循環。PCR產物5μl上樣，1.5 g／dl瓊脂糖凝膠中電泳1.0 h，電壓100 V，Gel Red染色，用凝膠成像系統觀察并掃描成像。

基因 aac（6’）－Ib－cr確定：用內切酶法從 aac（6’）－Ib的 PCR 陽性產物中檢測。用 BtsCI（New England Biolabs，Beverly，Mass）對aac（6’）－Ib陽性PCR產物進行酶切消化實驗。由于aac（6’）－Ib－cr缺乏內切酶BtsCI的酶切位點，而野生型具有此酶切位點。將酶切產物進行電泳后，兩條帶的為aac（6’）－Ib－cr陰性株即為aac（6’）－Ib；不能被酶切即只有一條帶者為aac（6’）－Ib－cr陽性株［3］。

1.2.4 統計學分析：采用SPSS11.0軟件進行統計學分析，比較分析aac（6’）－Ib－cr基因在不同菌種中的分布差異。比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌的耐藥情況 在上述4種菌株中，氨芐西林耐藥率最高，達75.3%，其次是頭孢唑林，耐藥率為58.5%；環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為25.1%和16.7%；哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星和亞胺培南的敏感率均在90%以上。具體耐藥情況見表1。

2.2 基因aac（6’）－Ib和aac（6’）－Ib－cr的陽性率共檢出aac（6’）－Ib基因29株，其中鮑曼不動桿菌5株，大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌13株；在銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib。有21株變異為aac（6’）－Ib－cr，變異率為72.4%（21／29）；aac（6’）－Ib－cr的總陽性率為7.0% （21／299），其中大腸埃希菌有9株及肺炎克雷伯菌有22株，其陽性率為11.67%（21／180），而在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib－cr（0.0%，0／119）。經χ2檢驗，兩者間的差異具有統計學意義（χ2＝14.932，P＜0.01）。

表1 299株臨床常見的革蘭陰性菌耐藥情況（%）

3 討論

隨著抗生素在臨床上的廣泛應用，細菌耐藥率也在不斷翻番。本研究在來自臨床299株常見的革蘭陰性桿菌中，氨芐西林耐藥率已高達75.3%，頭孢唑林的耐藥率為58.5%，復方新諾明的耐藥也接近50%，這說明曾經是抗感染的前線藥物，已經被細菌的反抗打垮了。但是這也催生了新藥的陸續出現，在抗感染的任務中，頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南等耐藥率在20%左右的抗菌藥可以發揮中間力量的作用。最后，拿出目前大家都公認的一線藥如亞胺培南、哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星等，在本研究中它們的敏感率都超過了90%。當然，最近還出現了如頭孢哌酮／舒巴坦、替加環素等新藥，針對耐碳青霉烯類藥物的細菌發揮著重要作用。縱使這樣，臨床醫生一樣要慎用抗生素，為抑制超級細菌的出現作出應有的貢獻；而且刻不容緩，因為已有研究報道［4］在ICU，鮑曼不動桿菌除了亞胺培南外，對其他如哌拉西林／他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮／舒巴坦、阿米卡星、左旋氧氟沙星等13種抗菌藥物的耐藥率均超過50%。

在本研究中，環丙沙星的耐藥率較高，達到了25.1%，要慎選，而左氧氟沙星耐藥率相對低一些（16.7%），可優先于環丙沙星選用；對于氨基糖甙類藥物，盡管阿米卡星耐藥率在5%以下，但是慶大霉素和妥布霉素耐藥率卻分別達到了19.7%和13.7%。因此，喹諾酮類和氨基糖甙類的抗菌活性也不容樂觀，細菌對其耐藥的機制研究也在不斷升溫。就aac（6’）－Ib－cr而言，它是世界上首次發現的能同時導致氨基糖甙類和喹諾酮類兩種藥物失活的一種酶［2］，而且還能提高暴露于環丙沙星的菌株發生染色體突變的幾率。另外，此研究還發現aac（6’）－Ib－cr是通過對喹諾酮類藥物哌嗪環上氨基氮原子的乙酰化作用而使環丙沙星失活而介導低水平耐藥，而對左氧氟沙星、莫西沙星等其它的喹諾酮類抗生素并不起作用（在結構上這些藥物合成時哌嗪環的氨基已被甲基取代），這種現象可以在一定程度上說明細菌為適應外界環境而發生了進化。甚至會不會出現能讓3種或3種以上的抗菌藥物耐藥的基因，這都是一種可怕而又可能的猜測。

在檢出aac（6’）－Ib基因29株中，鮑曼不動桿菌僅占5株，大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌13株；在銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib。也就是說腸桿菌科細菌占了82.8%（24／29），而非發酵菌僅占17.2%。同時有21株aac（6’）－Ib基因變異為 aac（6’）－Ib－cr，變異率為72.4%（21／29）；為什么 aac（6’）－Ib基因的變異率會如此高呢？這值得再深入研究。aac（6’）－Ib－cr的 總 陽 性 率 為 7.0% （21／299），其中大腸埃希菌有9株及肺炎克雷伯菌有22株，其陽性率為11.67%（21／180），而在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib－cr（0.0%，0／119）。經χ2檢驗，兩者間的差異具有統計學意義（P＜0.01）。為什么aac（6’）－Ib－cr在腸桿菌科細菌和非發酵細菌中的分布差異具有統計學意義，也許還需要進行大量研究，可能aac（6’）－Ib－cr基因還有更多的生物學價值有待發現。

［1］Hooper DC.Mechanisms of action and resistance of older and newer fluoroquinolones［J］.Clin Infect Dis，2000，31（suppl 2）：24.

［2］Robicsek A，Strahilevitz J，Jacoby GA，et al.Fluoroquinolone modifying enzyme：a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase［J］.Nat Med，2006，12：83.

［3］Park CH，Robicsek A，Jacoby GA，et al.Prevalence in the United States of aac（6’）－Ib－cr encoding a ciprofloxacin－modifying enzyme［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，9（11）：3953.

［4］詹鑾峰，高 鵬.關于ICU病房鮑曼不動桿菌耐藥性及基因型研究［J］.中國實驗診斷學，2011，15（7）：1137.