胎球蛋白－a對3T3－L1脂肪細胞脂肪分解的影響

馮娜娜，陶 婷

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 老年病科，上海 200025）

脂肪分解是人體能量代謝的核心反應之一。當機體有能量需求時，甘油三酯在特異性的脂肪酶的作用下分解為甘油和脂肪酸為機體提供能量。如果人體脂肪分解出現障礙，就會影響機體能量的平衡進而引發肥胖和胰島素抵抗等疾病。Fetuin－a是存在于正常哺乳動物血清中的一種糖蛋白，是胰島素受體酪氨酸激酶天然的抑制劑［1］。人的fetuin－a基因位于3號染色體q27位點上，該位點與代謝方面疾病密切相關［2］。Mathews ST等研究發現，fetuina基因敲除的小鼠能夠抵抗高脂飲食引起的肥胖［3］；而臨床研究表明體內fetuin－a的升高與肥胖發生密切相關［4］。但目前fetuin－a與肥胖相關的分子機制尚并不清楚。本研究旨在探討fetuin－a對3T3－L1脂肪細胞脂肪分解的影響及其可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3－L1前脂肪細胞株購自美國ATCC，牛血清胎球蛋白（fetuin－a）購自 Calbiochem 公司；高糖DMEM培養基購自美國GIBCO公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）購自PAA Laboratories Gmb H公司；地塞米松購自Merck公司；甘油檢測試劑盒、甘油標準品、1－甲基－3－異丁基黃嘌呤（IBMX）購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；Oligo（d T）Primer、d NTP、M－MLV 逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶為Promega公司產品；Real－time PCR試劑盒購自Takara公司；引物由Invitrogen公司合成；Phospho－HSL（Ser563）、ATGL、β－actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記的二抗購自Santa Cruz公司；CAMP ELISA試劑盒購自R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪細胞的培養與誘導分化3T3－L1前脂肪細胞用含10%FBS的高糖DMEM培養基在37℃，5%CO2條件下培養。細胞匯合后2 d，加入誘導液 A（10%FBS高糖 DMEM，含0.5 m M IBMX、1μM 地塞米松、10μg／ml胰島素）開始誘導。2天后，換成誘導液B（10%FBS高糖DMEM含10μg／ml胰島素）。2天后重新換10%FBS高糖DMEM繼續培養，隔天換液一次。誘導分化8天，細胞90%以上呈成熟脂肪細胞表型，可用于實驗。

1.2.2 甘油含量測定 分化成熟的脂肪細胞，以含0.2%牛血清白蛋白的DMEM孵育過夜，PBS洗3遍，加入含有不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h。用甘油檢測試劑盒測定各處理組培養液中的甘油濃度作為脂解率的指標，操作方法嚴格按照甘油檢測試劑盒說明書執行。

1.2.3 Real－time PCR測定 ATGL m RNA 的表達細胞分化成熟后用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h后，用Trizol試劑提取脂肪細胞總RNA。定量后取總RNA 2μg，以Oligo（d T）為引物進行逆轉錄反應，反應體系為25μl。按SYBR green PCR master mix試劑盒的說明書進行定量PCR擴增和檢測，所用ATGL引物序列為：上游引物：5’－CGTCACCTGTGCCTTACTC－3’，下游引 物：5’－GGGCTCAAACTCCCAAAC－3’。 用 βactin作為內參校正，采用相對定量方式表示各樣本目的基因的表達。實驗均重復3次。

1.2.4 Western blot測定 HSL、ATGL蛋白表達細胞分化成熟后用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h后，PBS洗3遍，再用蛋白提取裂解液裂解細胞，13 000×g離心20 min，吸取上清進行蛋白定量。取50μg樣品進行SDS－PAGE蛋白電泳，通過電泳儀將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h，再用5%脫脂奶粉稀釋一抗4℃雜交過夜，TBST（20 mmol／L Tris·HCl，p H 7.6；150 mmol／L NaCl；0.1%Tween20）洗3次，每次10 min；5%脫脂奶粉稀釋二抗，孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；最后以化學發光法（ECL）顯影。ImageJ分析電泳條帶密度值，目的蛋白表達水平以該條帶密度占β－actin條帶密度的百分比（%）表示。

1.2.5 c AMP濃度檢測 分化成熟的細胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，棄掉上清，PBS洗3遍，加入細胞裂解液裂解細胞后，按照c AMP ELISA檢測試劑盒說明書對細胞內c AMP進行檢測。測得的結果用總蛋白校正，數值以c AMP pmol／mg protein表示。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Fetuin－a抑制3T3－L1脂肪細胞基礎狀態下的脂肪分解

根據同類研究和本研究預試驗的結果，12 h是fetuin－a抑制脂肪細胞基礎脂肪分解的有效時間點。分化成熟的脂肪細胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40 μM）fetuin－a孵育12 h后，測定培養液中的甘油釋放量作為脂解率的指標。如圖1所示，隨著fetuin－a濃度的增加，脂肪細胞的甘油釋放顯著降低，并具有劑量依賴關系（P＜0.05）。其中40μM fetuin－a作用最顯著，能使脂肪分解下降約61%。

2.2 Fetuin－a對ATGL mRNA表達的影響

分化成熟的脂肪細胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，提取總 RNA，采用Real－time PCR法檢測目的基因的mRNA的表達。如圖2所示，與對照組相比fetuin－a能顯著抑制ATGL的 mRNA表達（P＜0.05）。

2.3 Fetuin－a對脂肪分解相關酶 HSL、ATGL蛋白表達的影響

分化成熟的脂肪細胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，提取細胞總蛋白，采用Western blot法檢測目的基因的蛋白表達。如圖3所示，與對照組相比fetuin－a能顯著抑制 HSL、ATGL的蛋白表達（P＜0.05，P＜0.05）。

2.4 Fetuin－a對細胞內cAMP含量的影響

為了了解fetuin－a影響脂肪分解的可能機制，我們檢測了脂肪分解的經典傳導通路－c AMP依賴的PKA通路。ELISA檢測結果顯示，fetuin－a作用12 h，能夠顯著降低細胞內c AMP的含量，并呈劑量依賴關系（P＜0.05，見圖4）。40μM fetuin－a使細胞內c AMP的含量下降最顯著，34%左右。

3 討論

圖1 Fetuin－a對3T3－L1脂肪細胞脂肪分解的影響

圖2 Fetuin－a對3T3－L1脂肪細胞ATGL mRNA表達的影響

本實驗的主要目的在于研究fetuin－a對脂肪分解的影響及其機制。Fetuin－a是存在于正常哺乳動物血清中的一種糖蛋白，其最初從牛血清中分離提純獲得，胚胎期可由肝臟、胰臟、腎臟等多種組織器官合成分泌，成年后則主要由肝臟合成分泌入血清［5］。人的fetuin－a基因位于3號染色體q27位點上，該位點與代謝方面疾病密切相關［2］。在飲食誘導的肥胖小鼠的動物實驗中，與對照組比較肥胖小鼠血清fetuin－a的含量明顯增加。Fetuin－a敲除的小鼠給予高脂飲食時，與正常小鼠比較脂肪沉積明顯減少并能抵抗由此引起的肥胖［3］。臨床研究發現，fetuin－a升高與內臟脂肪沉積有關［6］。病人在體重減輕后，血清中fetuin－a也明顯降低［7］。Chen HY等人發現在非糖尿病血透病人中，血清中fetuin－a水平最高組軀干肥胖的發生率是最低組的3.2倍［4］。以上研究提示fetuin－a與肥胖有關。脂肪分解異常會導致肥胖，皮下脂肪組織中兒茶酚胺誘導的脂肪分解受損是肥胖患者的一個常見特征［8，9］。本研究通過測定細胞培養液中的甘油釋放量證實fetuin－a以劑量依賴的方式抑制脂肪細胞的脂肪分解，表明fetuin－a是脂肪分解的重要的抑制因子。

圖3 Fetuin－a對3T3－L1脂肪細胞phospho－HSL和ATGL蛋白表達的影響

圖4 Fetuin－a對3T3－L1脂肪細胞內cAMP含量的影響

HSL是經典的脂肪分解反應限速酶，其表達水平降低及活性減弱均會導致機體脂肪分解率下降。機體通過c AMP－PKA通路調節 HSL的活性，c AMP是該信號通路中的重要的第二信使。在激素的作用下Gs偶聯的受體被激活，從而激活c AMP，導致細胞內c AMP水平增加，進而激活PKA。PKA使HSL磷酸化，磷酸化的HSL從胞漿向脂滴表面轉位從而分解脂滴內甘油三酯［10］。本實驗通過western blot檢測細胞內磷酸化HSL的含量，通過ELISA檢測檢測細胞中c AMP的含量。結果表明，fetuin－a能夠降低細胞內c AMP及磷酸化HSL的含量。據此推測，fetuin－a通過降低細胞中c AMP的含量，抑制了細胞中HSL的磷酸化過程，從而抑制了脂肪細胞的脂肪分解。

ATGL是體內脂肪分解的另一種限速酶，已證實ATGL主要水解甘油三酯為甘油二酯，其與HSL共同提供體內大約95%的脂肪水解活性［11］。其表達水平降低同樣會導致機體脂肪分解率下降。本實驗發現fetuin－a能夠明顯降低細胞內ATGL m RNA及蛋白的表達，推測這與fetuin－a抑制脂肪分解相關。

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