橘紅色形態標記在抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系轉育中的應用

耿新翠 沈向群 李 茜 陳永浩 郭艷峰

（沈陽農業大學園藝學院，遼寧沈陽 110866）

根腫病由根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引起，是十字花科作物的一種專性寄生病害，在世界上許多國家都有發生，并且給十字花科作物生產造成了巨大損失。大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕由于生長期長、生長期間氣候條件適宜根腫菌侵染而發病更加嚴重（Dixon，2009）。近年來我國根腫病發病面積逐年擴大，大白菜、普通白菜等十字花科作物的產量和品質嚴重下降（孫保亞和沈向群，2005）。橘紅心大白菜是大白菜中的稀有顏色，營養和保健價值比普通大白菜高出許多倍（張德雙 等，2004），是大白菜球心色和品質育種的一個有價值的發展方向。但是根腫病發病面積的迅速擴大勢必影響到橘紅心大白菜在我國的栽培，轉育橘紅心大白菜抗根腫病雄性不育系雖然是解決根腫病為害的一個有效手段，但是轉育過程中需要進行抗性鑒定、育性調查和球心色篩選，這是一個繁瑣的過程。

形態標記具有直觀、簡單、無需任何分析就可以直接得到結果的優點，是所有標記方法中最簡單、最直觀、最經濟的方法，也是遺傳研究和雜種鑒定常用的傳統方法（龐金安 等，2009）。利用形態標記可以提高種子純度和選育效率（吳新杰 等，2005）。隨著雜種優勢的利用和發展，形態標記在雜種鑒別、純度鑒定和品種權益保護中具有重要意義。橘紅心大白菜的球心色由1對隱性等位基因控制（余陽俊 等，1993），花色、子葉顏色與球心色的遺傳關系是一因多效，根據子葉顏色或花色就能判斷其球心色，可以把子葉顏色和花色作為橘紅心大白菜的形態標記性狀在育種中加以應用（李躍飛，2011）。本試驗在轉育抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系的過程中用球心色法、子葉法和花色法分別篩選橘紅心性狀，對這3 種方法的應用過程進行比較、分析，提出了簡化抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系轉育進程的方法，為橘紅心大白菜形態標記在育種中的應用提供了一定的實踐經驗和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

抗根腫病白心大白菜甲型兩用系（CRAB9112A）與橘紅心大白菜自交系LH 雜交后代F1分別進行回交和系內交得到的BC1F1和F2，回交親本為LH。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 本試驗于2010～2011年在沈陽農業大學蔬菜基地進行。

第1 組試驗于2010年7月2日進行，BC1F1和F2種子各2 份，第1 份浸種后放在培養皿中，室溫暗箱條件下培養，子葉展開（2～3 d）后，置于陽光下2 h 后調查子葉顏色，7月5日統計橘紅色子葉和黃色子葉的幼苗數目，橘紅色子葉幼苗與第2 份種子同時進行抗性鑒定，8月7日進行抗性調查，抗病的植株栽到大田中，結球期第1 份調查經濟性狀，第2 份調查經濟性狀和球心色。11月初收獲后，存放在地窖中。立春前后栽到花盆中，開花后調查育性。

第2 組試驗于2010年6月進行，BC1F1和F2種子各2 份，分別浸種催芽后春化（0～3 ℃，遮光）處理30 d（6月5日～7月5日），春化結束后第1 份置于陽光下2 h 后，統計橘紅色子葉和黃色子葉的幼苗數目，橘紅色子葉幼苗與第2 份同時（7月5日）進行抗性鑒定，8月7日進行抗性調查，抗病的植株栽到穴盤內（50 穴·盤-1），開花后分別調查花色、育性。

1.2.2 抗性篩選方法 采用菌土置入法接菌，供試菌種為沈陽新民大白菜主產區采集的根腫病菌。按照15 g 鮮質量病根配制100 mL 菌液〔利用菌落計數法計算菌液孢子濃度，應達到12×107個·mL-1（高橋賢司和劉學敏，1989）〕加入300 g 風干草炭土的比例配制菌土，在23～28 ℃條件下密封48 h，使其充分發酵。將發酵過的菌土放入每穴的中央（50 穴·盤-1），每穴放菌土9 cm3，種子或芽保證播到菌土上，苗床地溫控制在25 ℃左右，土壤濕度保持在90%左右，pH值控制在6～7，為植株發病營造良好條件，30 d 后洗根，進行調查。

1.2.3 樣本容量 樣本容量按n≥lg（0.01）/lg（1-p）求得，式中n為樣本容量，p為目標基因發生概率。

2 結果與分析

2.1 抗根腫病橘紅心大白菜篩選過程比較

抗根腫病橘紅心大白菜不育系轉育時第2 代（F1進行回交或系內交得到的）是得到橘紅心植株的關鍵步驟。非種子春化處理時，球心色法先抗性篩選，抗病植株球心色和經濟性狀的篩選在大田里同時進行，然后在經濟性狀符合要求的抗病橘紅心植株中進行育性調查，得到需要的育性基因型；子葉法先調查子葉顏色，只有橘紅色子葉幼苗進行抗性篩選，抗病橘紅心植株進行經濟性狀調查，符合要求的做育性調查。子葉法和球心色法相比，抗性篩選和球心色（或子葉色）調查先后順序不同，但都是最后進行育性鑒定。具體過程如圖1所示。從表面看，利用子葉法篩選橘紅心植株似乎更繁瑣，其實不然，子葉法操作簡單方便，僅需要2～3 d 就可以完成，可以說兩種方法在時間耗用上幾乎是一樣的。

圖1 非種子春化處理抗根腫病橘紅心大白菜篩選方法比較

種子春化處理時幼苗不經過結球期直接進入開花期，通過子葉顏色和花瓣顏色都可以找到橘紅心植株，所以橘紅花和橘紅子葉都可以作為形態標記性狀用于篩選橘紅心植株，但是二者在具體應用時有所不同。花色法在春化處理結束后進行抗性篩選，抗病植株開花后花色和育性調查同時進行。而子葉法在春化處理結束后，幼苗先在陽光下照射2 h，橘紅心幼苗子葉顏色由黃色變為橘紅色而白心幼苗子葉依然是黃色，淘汰黃色子葉幼苗，橘紅色子葉幼苗進行抗性鑒定，抗病橘紅心植株開花后調查育性。具體過程如圖2所示。可以看出，與非種子春化處理類似，子葉法和花色法相比，也是抗性篩選和花色（或子葉色）調查順序不同，耗用時間幾乎一樣。

圖2 種子春化處理抗根腫病橘紅心大白菜篩選方法比較

因此，球心色法、花色法和子葉法相比，球心色法是經濟性狀調查和球心色調查同時進行，花色法是花色調查和育性調查同時進行，而子葉法是子葉色、抗性、經濟性狀、育性逐一篩選。另外，子葉法在種子春化處理和非種子春化處理應用過程基本相同，只是種子春化處理少了田間經濟性狀調查這一階段。

2.2 不同方法篩選理想橘紅心植株各步驟比較

在轉育抗根腫病橘紅心大白菜核基因雄性不育系過程中，無論是種子春化處理，還是非種子春化處理，抗性篩選、球心色調查和育性調查缺一不可。方法和材料不同時，抗性篩選、球心色調查所需要的株數也會不同。

當F1通過回交得到橘紅心植株時，BC1F1抗病和感病、白心和橘紅心、可育和不育的理論分離比都是1∶1。非種子春化處理，球心色法每一份材料需要40 株進行抗性篩選，選出的抗病植株約20 株進行球心色和經濟性狀調查，最后選7 株抗病橘紅心植株進行育性調查（表1）。子葉法先從40 株子葉展開的幼苗中淘汰子葉黃色的幼苗，保留橘紅色子葉的幼苗約20 株進行抗性篩選，抗病植株10 株左右進行經濟性狀篩選，選7 株進行育性調查（表2）。在調查總數相同的情況下，子葉法抗性篩選株數、經濟性狀調查株數只有球心色法的50%左右。

種子春化處理時，子葉法在春化處理后先調查40 株幼苗子葉顏色，橘紅色子葉幼苗約20 株進行抗性篩選，選7 株抗病橘紅心植株盆栽進行育性調查（表3）。花色法先對40 株幼苗進行抗性篩選，抗病植株約20 株盆栽進行花色和育性調查（表4）。花色法需要抗性篩選和育性調查株數多，而子葉法在抗性鑒定前淘汰了非橘紅心幼苗，抗性篩選和育性調查株數大大減少。

除了抗性篩選株數和育性調查株數不同外，從調查過程所需時間來看，非種子春化處理子葉法和球心色法相比，子葉法比球心色法多了子葉調查這一步驟，但是從各個步驟所需要的時間來看，抗性篩選30 d，經濟性狀調查100 d 左右，子葉調查僅僅需要2～3 d 的時間。同樣，種子春化處理子葉法也是多了子葉顏色調查這一步驟，但是這一步驟費時更短，僅僅需要幾個小時的時間。可以說，從BC1F1獲得理想橘紅心植株，球心色法和子葉法或者花色法和子葉法所需時間差別不大，但子葉法不僅抗性篩選株數少，大田種植或盆栽株數也減少許多，這意味著在管理過程中工作強度降低，節省了人力和物力。

F1兄妹交得到橘紅心植株（F2），抗病和感病理論分離比是3∶1，抗病植株較多，約占總株數的3/4，白心和橘紅心理論分離比是3∶1，但橘紅心植株約占總株數的1/4；育性基因型理論分離比為1∶1∶1∶1（MS fMS∶MS fms∶msms∶Msms）。在這種情況下，為了得到理想的基因型，子葉法更加顯示出其優勢（表5～8）：在總調查株數為96 株的前提下，先確定橘紅心植株，淘汰了約占總數3/4 的非橘紅心植株，只有1/4 橘紅心幼苗進行抗性篩選，而其他方法抗性篩選株數都是96 株；相應地，非種子春化處理子葉法大田種植株數大約為球心色法的1/3，種子春化處理子葉法盆栽株數大致為花色法的1/3。由此可見，從F2篩選理想的橘紅心植株，子葉法依然是最簡便、省力的方法。

表1 非種子春化處理球心色法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表2 非種子春化處理子葉法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表3 種子春化處理子葉法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表4 種子春化處理花色法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

與BC1F1獲得理想橘紅心植株相比，F2要獲得理想橘紅心植株，球心色法抗性篩選株數、經濟性狀調查株數和育性調查株數明顯增加；花色法抗性篩選株數、盆栽株數也明顯增加；子葉法先淘汰了約占總數3/4 非橘紅心幼苗，抗性篩選總數反而明顯減少。因此，當橘紅心植株出現的概率由回交時的1/2 降為系內交的1/4，調查總數增加時，子葉法由于首先淘汰了占多數的非橘紅心植株而使隨后的抗性、經濟性狀和育性調查株數大幅縮減，這對于后期的管理工作十分有利，這說明隨著橘紅心出現概率的降低，子葉法變得更加方便、實用。

2.3 不同方法根腫菌菌土用量比較

抗性鑒定時，每穴放菌土9 cm3，定苗2株。從表9 可以看出，材料相同時，球心色法和花色法菌土耗用量相同，子葉法菌土耗用量較少；材料不同時，同一種方法菌土耗用量不同。F2獲得抗病橘紅心植株的概率（3/16）低于BC1F1（1/4），所以F2調查群體增加，球心色法和花色法菌土耗用量也相應增加。但是，由于F2獲得抗病植株的概率（3/4）高于BC1F1（1/2），子葉法的抗性篩選群體反而減少，菌土耗用量低于BC1F1。這說明在轉育橘紅心材料時，子葉法可以先淘汰非橘紅心植株，省去了非橘紅心材料的抗性篩選，減少了抗性篩選群體，節省了菌土。

表5 非種子春化處理球心色法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表6 非種子春化處理子葉法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表7 種子春化處理子葉法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表8 種子春化處理花色法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調查株數 株

表9 不同條件下、不同方法BC1F1和F2獲得抗根腫病橘紅心植株抗性篩選所需菌土量比較

3 結論與討論

形態標記性狀除了穩定性強之外，特征必須明顯，易于識別，如果能夠早期識別更好（龐金安 等，2009）。橘紅色子葉對黃色子葉、橘紅花對黃花顏色差別明顯，容易區分，適合作為形態標記加以運用。非種子春化處理，橘紅花形態標記在植株生長后期開花期才得以表現，比球心色表現的晚，所以沒有必要使用。如果不調查經濟性狀直接種子春化處理，可以在花期利用這一性狀確定橘紅心植株，但管理的工作量會增加。橘紅色子葉形態標記在種子子葉展開時就表現出來，可以早期識別橘紅心植株，并且無論非種子春化處理還是種子春化處理都可以在幼苗期將橘紅心植株挑選出來，應用價值較高。

本試驗以轉育抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系的BC1F1和F2為試材，在非種子春化處理和種子春化處理兩種條件下比較了球心色法、子葉法和花色法得到抗根腫病橘紅心植株的過程，得出如下結論：第一，球心色法是經濟性狀調查和球心色調查同時進行，花色法是花色調查和育性調查同時進行，子葉法是子葉色、抗性、經濟性狀、育性逐一篩選。第二，非種子春化處理，子葉法比球心色法抗性鑒定群體小，田間調查株數少；種子春化處理子葉法比花色法抗性鑒定群體小，盆栽株數少。第三，F2樣本容量雖然比BC1F1大，但子葉法的抗性鑒定群體反而減少。這說明在橘紅心植株出現的概率較小調查群體增加時，子葉法可以早期淘汰非橘紅心植株，減少勞動量，方便以后的管理。第四，從根腫菌菌土耗用量來看，子葉法需要的菌土量最少，抗性鑒定結束后需要滅菌的土量也最少。根腫菌休眠孢子生活力很強，在土壤中可以存活10 a以上。化學藥劑防治困難，同時還會帶來環境污染等問題。子葉法在抗性鑒定時減少了菌土耗用量，也就是說抗性鑒定結束后要處理的帶菌土量也隨之減少，這對于減少或防止試驗后根腫菌污染也是有利的。因此，球心色法、子葉法和花色法3 種方法中，子葉法適用范圍最廣，最經濟，最方便，是篩選橘紅心抗病品種和不育系的理想方法。

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