白菜類作物葉片長寬性狀QTL定位分析

鄧 杰 王 輝 程 鋒 武 劍 王曉武

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業部蔬菜遺傳與生理重點開放實驗室，中-荷聯合園藝作物基因組技術實驗室，北京 100081）

白菜類蔬菜是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）蕓薹種（B.campestrisL.）中的栽培亞種群。它包含白菜亞種〔ssp.chinensis（L.）Makino〕、大白菜亞種〔ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕、蕪菁亞種（ssp.rapiferaMetzg）。隨著栽培歷史的發展，在這些亞種中又有變種、類型及其品種的逐漸分化，已成為我國栽培蔬菜中龐大的亞種、變種及其品種的群體。

葉部是白菜類作物的主要食用部位，也是影響其產量和品質的重要指標之一。對白菜類作物葉片性狀的深入研究對提高其產量和選擇不同葉片表型的育種材料具有重要的意義。目前，對白菜類作物的QTL 研究主要集中在抗病性（Matsumoto et al.，1998；盧鋼 等，2002）、抗逆性和抽薹開花（Axelsson et al.，2001；Kole et al.，2002；于拴倉 等，2004）等方面，專門針對葉部形態學進行QTL 定位的研究工作還較少。本試驗利用兩個白菜類作物DH 群體和已構建的遺傳連鎖圖譜，針對葉長、葉寬及葉片形態指數性狀進行QTL 定位和分析，這將為白菜類作物分子標記輔助育種起到積極的推動作用。

1 材料與方法

1.1 DH 群體和遺傳連鎖圖譜

本試驗使用2 個DH 親本Z16〔大白菜，Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕和L143（白菜型油菜，Brassica campestrisL.var.yellow sarsonPrain）及1 個多代自交親本蘇州青〔普通白菜，BrassicacampestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕構建了2 個各含有120 個株系的DH 群體：Z16_L143 BC2DH 和Z16_SZQ F1DH。用于構建群體的親本間在葉片形態方面存在顯著差異。利用已構建的上述2 個群體分別具有143、230 個InDel 標記的遺傳連鎖圖譜對葉片形態學性狀進行QTL 分析。

1.2 群體種植和性狀調查

由于供試群體存在易抽薹的現象，將Z16_SZQ F1DH 群體于2011年5月播種于紗棚中，Z16_L143 BC2DH 群體于2011年10月播種于溫室中，上述試驗均在中國農業科學院蔬菜花卉研究所進行。群體內每株系3 次重復，常規栽培管理。播種后約60 d 在株系抽薹開花之前選取自外層起第5 片或第6 片完整無缺損的葉片，進行拍照并掃描，利用+LA-S 全能型植物圖像分析系統測量葉長（LL）、葉寬（LW），計算葉片形態指數（LW/LL）。性狀測量的具體標準參照李威等（2009）的方法。

1.3 數據統計和QTL 分析

基于本實驗室已構建的兩個DH 群體的分子遺傳圖譜，用MAPQTL 4.0 軟件進行葉片形態學性狀的QTL 分析。形態學性狀數據以3 次重復的平均值進行QTL 分析。首先利用置換測驗做1 000 次重復，估算基因組范圍內α=0.05 水平上的LOD 閾值。在本試驗中，根據每個性狀每條連鎖群Permutation test 檢測到的95%置信區間的LOD 值作為閾值。利用區間作圖法（IM）進行QTL 分析，在每條染色體上每隔1 cM 對QTL 存在的可能性掃描1 次。對于IM 分析檢測到的QTL，將最高LOD 值所在位置的標記或與其緊密連鎖的標記作為協同因子，對IM 檢測到的QTL 進行多座位QTL 模型（MQM）檢測。以連鎖群上LOD 值最高的位置作為QTL 的位置（van Ooijen，1992）。

1.4 白菜類作物自然群體中候選基因表達量與葉片形態指數關聯分析

利用包括大白菜、普通白菜、蕪菁、烏塌菜、菜薹等95 份不同材料組成的白菜類作物自然群體（表1），提取植株5～6 片真葉時期蓮座葉葉片的總RNA，進行轉錄組測序。該數據用于分析植株蓮座期可能候選基因表達量與葉片形態指數之間的相關性。

表1 白菜類作物自然群體中表達譜測序的95 份材料

1.5 候選基因序列分析

BrXTH9基因序列來源于大白菜基因組計劃公布的全基因組序列及白菜注釋基因數據庫（http://brassicadb.org/brad/），信號肽剪接位點的預測通過SignalP 軟件完成（Nielsen et al.，1997）。文中引用的其他物種XTH家族基因均來源于NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），序列比對通過Clustal W 軟件完成（Altschul et al.，1990）。

2 結果與分析

2.1 親本間葉部形態學性狀的差異以及在DH 群體中的變異

由圖1 可知，親本Z16 葉片形態指數（LW/LL）較大，表現為較為寬扁的表型（圖1-A）；SZQ及L143 葉片形態指數較小，表現為較為細長的葉片表型（圖1-B、C），親本之間存在著顯著差異。在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 群體中，葉片形態指數性狀分離明顯（圖1-D～O）。

由表2、3 可知，構建DH 群體的親本之間葉柄長、葉片長及葉片形態指數性狀經過t檢測，存在顯著的差異。因而用該群體檢測可能獲得控制葉片相關性狀的QTL。

圖1 親本葉片形態指數表型及在DH 群體中的分離情況

表2 Z16_L143 BC2 DH 群體親本葉部形態學性狀及在DH 群體中的分布

表3 Z16_SZQ F1 DH 群體親本葉部形態學性狀及在DH 群體中的分布

2.2 葉部形態學性狀的QTL 定位及基因效應分析

利用已構建的分子遺傳圖譜，采用多座位QTL 模型對白菜類作物葉部形態學性狀進行QTL分析。兩個DH 群體中，在6 個連鎖群上共檢測到9 個QTLs 位點。其中6 個QTLs 與葉長相關，2 個QTLs 與葉片形態指數相關，1 個QTL 與葉寬相關。這些QTLs 分別位于A01、A03、A05、A06、A09 和A10 上（表4，圖2、3）。

控制葉長的QTL 在Z16_SZQ F1DH 群體中共檢測到3 個，分別命名為LL-1、LL-2 和LL-3，分別位于A01、A06 與A09 連鎖群上。3 個QTLs 解釋的遺傳貢獻率在7.1%～13.4%之間，其中LL-3 的遺傳貢獻率最小，LL-1 為減效位點，LL-2 和LL-3 為增效位點（表4）。這3 個QTLs 解釋的總變異為29.0%。

表4 葉部形態學性狀的QTL定位及其基因效應

圖2 葉部形態學性狀QTL在Z16_SZQ F1 DH 群體分子遺傳圖上的分布

圖3 葉部形態學性狀QTL在Z16_L143 BC2 DH 群體分子遺傳圖上的分布

同時在Z16_L143 BC2DH 群體中也檢測到3 個控制葉長的QTLs，分別命名為LL-4、LL-5 和LL-6，分別位于A03、A09 與A10 連鎖群上。這3 個QTLs 解釋的遺傳貢獻率在8.4%～12.8%之間，且全部是增效位點，可解釋的總變異為32.3%（表4）。兩個群體中都在 A09 連鎖群上檢測到 1 個控制葉長的QTL：LL-3 與LL-5。將這2 個QTLs 兩側標記引物序列分別與大白菜基因組序列（http://brassicadb.org/brad/）比對，結果表明BrID10549 和BrID10541 的位置相近且都位于Scaffold000006 上。

圖4 葉片形態指數QTL在Z16_SZQ F1 DH 群體A03 連鎖群上的分布

控制葉片形態指數（LW/LL）的QTL 在兩個群體中分別各檢測到1 個，都位于A03 連鎖群上。將在Z16_SZQ F1DH 群體中檢測到控制葉片形態指數的QTL 命名為LW/LL-1，可解釋的遺傳貢獻率為 28.1%，在 Z16_L143 BC2DH 中檢測到控制葉片形態指數的 QTL 命名為LW/LL-2，可解釋的遺傳貢獻率為15.7%。根據大白菜基因組計劃公布的全基因組序列及親本Z16 與蘇州青的重測序結果，設計InDel 標記，在Z16_SZQ F1DH 群體中對檢測到的控制葉片形態指數的QTL 區域進行標記加密。結果表明在BrID111431 位點處檢測到1 個較為顯著的QTL，其LOD 值為6.47，可解釋22.7%的表型變異（圖4）。將在標記加密后的Z16_SZQ F1DH 群體及Z16_L143 BC2DH 群體中A03 連鎖群上檢測到的葉片形態指數相關的QTL 側翼標記引物序列與大白菜基因組序列比對分析發現，BrID10459 位于Scaffold000001 上5388767 位點處，BrID10155位于Scaffold000005 上1335769 位點處，BrID111431 位于Scaffold000001 上4719555 位點處，表明兩個群體中A03 連鎖群上檢測到的葉片形態指數相關的QTL 位于染色體上相近的位置。

控制葉寬的QTL 只在Z16_L143 BC2DH 群體中檢測到1 個，命名為LW-1，位于A05 連鎖群上。這個QTL 解釋的遺傳貢獻率為15.6%，為減效位點，效應值為-10.88。

2.3 葉片形態指數候選基因分析

對Z16_SZQ F1DH 群體中檢測到的葉片形態指數A03 連鎖群上QTL 位點處標記BrID111431的帶型與葉片形態指數表型性狀進行對應分析，結果表明（圖5），葉片形態指數最小的10 個株系其帶型均為b，表明這些株系在該標記處的等位基因來源于親本SZQ；而葉片形態指數最大的10 個株系在BrID111431 位點處的帶型均為a，表明這些株系在該位點的等位基因均來源于Z16。上述結果表明在標記BrID111431 位點處，來源于Z16 的等位基因會導致葉片形態指數變大，而來源于SZQ 的等位基因會導致葉片形態植株變小。

圖5 Z16_SZQ F1 DH 群體中葉片形態指數最大與最小的10 個株系及其帶型

通過白菜注釋基因數據庫（http://brassicadb.org/brad/）找到BrID111431 標記上下游注釋基因進行分析。結果表明（表5），該標記上下游的各5 個注釋基因與擬南芥的注釋基因均具有線性關系，包括細胞壁松弛與重排的基因（Bra000840）、與激素Aux/IAA 蛋白結合的基因（Bra000842）、WD40 家族成員基因（Bra000849）、兩個功能未知的基因（Bra000841、Bra000854）等。

將BrID111431 上下游各5 個注釋基因的物理位置錨定到A03 連鎖群上Scaffold000001（圖6），分別位于該標記上下游各54 Kb、24 Kb 的區域內。

利用95 份白菜類作物構成的自然群體表達譜數據檢測結果，通過SPSS 軟件對檢測到的控制葉片形態指數QTL 位點：標記BrID111431 上下游各5 個基因的表達量與田間單株測量的葉片形態指數進行了相關性分析。結果表明（表6），有3 個白菜注釋基因的表達量與葉片形態指數表現出極顯著的相關性，分別為Bra000840、Bra000846、Bra000847。Bra000847表達量與葉片形態指數的相關系數最高，為0.439。該基因是擬南芥AT4G03070的同源基因，在擬南芥中參與到硫苷合成的相關途徑中（Kliebenstein et al.，2001），該基因突變或過表達并不能引起擬南芥葉片表型的突變。Bra000846是擬南芥AT4G03080的直系同源基因，對BRI1基因有抑制作用，具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用，該基因的突變體也不能引起擬南芥葉片表型變異。注釋基因Bra000840為擬南芥中AtXTH9（AT4G03210）的直系同源基因，屬于XTH基因家族的成員。該基因在細胞的伸長及細胞體積膨大過程中起著十分重要的作用。XTH家族在催化細胞壁形態改變的過程中主要有兩個步驟：首先內切木葡聚糖分子，再次將產生的木葡聚糖分子一端連接到另一個木葡聚糖分子的非還原端，從而對細胞的延展性進行調節。Shin 等（2006）研究表明從白菜類作物中克隆的AtTXTH9的直系同源基因BcXTH1轉化到擬南芥中過表達會導致蓮座期葉片特異性變寬、葉片形態指數變大，生殖生長時期的花莖等器官特異性變長。本試驗中檢測到的葉片形態指數相關的QTL 定位在標記BrID111431 位點上，該標記距離BrXTH9基因約54 Kb，為AtXTH9與BcXTH1的直系同源基因，而BrID111431 附近的其他基因在擬南芥突變體庫中并沒有發現會引起表型的變化報道（http://www.arabidopsis.org/），同時BrXTH9在95份白菜類作物自然群體中的表達譜數據與葉片形態指數具有極顯著的相關性，該基因表達量增大會伴隨著群體中葉片形態指數變大的趨勢，因而將BrXTH9基因作為可能控制葉片形態指數的候選基因。

表5 白菜類作物中葉片形態指數A03 連鎖群上QTL區域注釋基因

圖6 白菜類作物中BrID111431 上下游各5 個基因及其物理位置

表6 白菜類作物自然群體中BrID111431 上下游10 個注釋基因表達量與葉片形態指數相關性

2.4 BrXTH9 序列分析

BrXTH9是從親本Z16 與SZQ 的cDNA 克隆出來的，測序表明該基因序列全長為873 bp，共編碼290 個氨基酸（圖7），兩親本之間該基因的編碼產物無差異。BrXTH9與擬南芥中直系同源基因AtXTH9在核酸水平上的相似性為 88.1%，利用 SignalP 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對BrXTH9氨基酸序列進行信號肽預測，結果表明在N-末端有1 個可能存在的信號肽，表明BrXTH9編碼產物可能是分泌蛋白。利用N-X-T/S 模型對BrXTH9編碼氨基酸的N-末端糖基化位點進行預測，結果表明氨基酸序列中Asn54和Asn108為可能存在的糖基化位點（圖7）。XTH基因保守的結構域（DEIDFEFLG）在BrXTH9編碼氨基酸中位于98～107位點，并存在兩個氨基酸（NEF DFEFLG）的突變。

圖7 BrXTH9 序列分析

2.5 白菜類作物中BrXTH 基因家族進化分析

至今，在擬南芥中共發現33 個XTH基因家族成員，AtXTH1-AtXTH33。而在白菜類作物中只報道了AtXTH9的直系同源基因BcXTH1，其他XTH基因家族成員仍沒有相關的報道。在本試驗中，以大白菜基因組計劃公布的白菜全基因組序列及注釋基因數據庫（http://brassicadb.org/brad/），在大白菜中共找到了39 個BrXTH基因家族成員（圖8）。擬南芥33 個XTH家族成員中的4 個XTH基因（AtXTH1、AtXTH2、AtXTH20、AtXTH24）在大白菜中沒有找到直系同源基因。大白菜中不同拷貝之間的親緣關系更近。

確定的大白菜中控制葉片形態指數可能的候選基因BrXTH9與擬南芥AtXTH9為直系同源基因，該基因在大白菜中有兩個拷貝（圖8），AtXTH9可分為獨立的分支。同時發現，XTHs在大白菜中存在個拷貝現象，這可能是擬南芥屬與蕓薹屬在進化過程中分化后大白菜基因組加倍所造成的。

圖8 XTH 基因家族進化分析

3 結論與討論

葉片大小直接關系到白菜類作物的產量和品質，而葉片形態指數又與外觀品質緊密相關，對這些性狀的QTL 分析及主效位點的確定，將為白菜類作物品質改良育種提供依據。本試驗在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 兩個群體中研究了葉長、葉寬及葉片形態指數3 個性狀。結果表明，兩個群體中都在連鎖群A03 Scaffold000001 上相近的區域檢測到1 個控制葉片形態指數的QTL，在連鎖群A09 上都檢測到1 個控制葉長的QTL，但只在1 個群體中檢測到針對葉寬的QTL，可能是該性狀易受到環境或其他生理條件的影響。

Lou 等（2007）利用L143 與PC-175 構建的71 個株系的DH 群體將葉長、葉寬及葉片形態指數3 個性狀定位在連鎖群A02、A03、A06 和A09 上，本試驗同樣在連鎖群A03 上定位到了葉片形態指數的QTL。李威等（2009）利用大白菜材料構建的DH 群體對葉長與葉寬等性狀進行了QTL 分析，在4 條連鎖群上共獲得了12 個相關的QTLs，其中在連鎖群A09 上同樣檢測到1 個與葉長相關的QTL。

通過分析Z16_SZQ F1DH 群體中檢測到的控制葉片形態指數的QTL 區域，將該QTL 區域中大白菜與擬南芥注釋基因進行比對，發現大白菜基因組中在該區域存在擬南芥AtXTH9（Hyodo et al.，2003）的直系同源基因，有研究表明白菜型油菜中AtXTH9的直系同源基因BcXTH1與葉片的大小形態相關，該基因過表達會導致蓮座期葉片特異性變寬，葉片形態指數增大（Shin et al.，2006）。本試驗中利用95 份白菜類作物的自然群體對該基因的表達量與葉片形態指數相關性分析，發現兩者之間存在極顯著相關性，BrXTH9基因表達量高，則葉片形態指數有變大的趨勢。在擬南芥中，AtXTH9編碼產物葡聚糖水解酶蛋白參與細胞壁的松弛與重排并促進細胞的伸長（Rose et al.，2002），但其具體功能還有待于進一步研究。

利用大白菜全基因組信息，本試驗分析了大白菜中XTH家族成員的進化關系，相對于擬南芥33 個XTH家族中的29 個成員，在大白菜中共鑒定出了39 個直系同源基因。通過比對分析表明BrXTH9與AtXTH9在核酸水平存在很高的序列相似性。擬南芥中XTH成員編碼的氨基酸序列存在1 個高度保守的結構域（DEI DFEFLG），但是Hyodo 等（2003）研究表明XTH9存在兩個氨基酸的替換（NEF DFEFLG），本試驗結果也發現了同樣的突變位點。這表明BrXTH9可能與AtXTH9及BcXTH1存在同樣的作用機制。

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