黃連溫膽湯調(diào)控NLRP3炎癥小體抗動脈粥樣硬化機制

楊金果 鞠建慶 湯獻文 嚴(yán)權(quán)浩

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(龍崗)，廣東 深圳 518000；2中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院)

心血管疾病(CVD)是全球首要死亡原因，嚴(yán)重威脅著人類身體健康，在我國，無論是冠心病還是腦卒中，其患病人數(shù)和死亡人數(shù)仍呈上升趨勢，心血管病的疾病負(fù)擔(dān)持續(xù)加重〔1〕。動脈粥樣硬化(AS)是CVD的共同病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)學(xué)說是主流學(xué)說之一。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3炎性體是目前研究較為廣泛和深入的炎性體，可促發(fā)炎癥反應(yīng)〔2〕，在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用〔3，4〕。黃連溫膽湯是臨床經(jīng)典方，廣泛用于冠心病的治療，動物實驗亦表明其具有降脂、穩(wěn)定斑塊作用〔5〕。但其是否可通過抑制NLRP3炎癥小體活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用尚無報道。本項目選取黃連溫膽湯為干預(yù)措施，采用高脂飼料飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠為AS動物模型，以NLRP3炎癥小體作為切入點，探究黃連溫膽湯抗AS的干預(yù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及飼料 SPF級7～8周齡雄性ApoE-/-小鼠24只及相同周齡及遺傳背景的雄性C57BL/6J小鼠6只，體質(zhì)量(25±5)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006，批號：1100111911017204。高脂飼料：購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：京飼證(2014)06057，批號：1103221900009954。

1.1.2實驗藥物 黃連溫膽湯(黃連10 g、半夏15 g、竹茹10 g、枳實15 g、陳皮15 g、茯苓15 g、 生姜5 g、炙甘草5 g)中藥飲片置于煎藥機內(nèi)，加5倍于藥材質(zhì)量的純凈水浸泡1 h，大火煮沸30 min，無菌紗布過濾，藥渣再加5倍于藥材質(zhì)量的純凈水煮沸20 min，過濾后合并兩次濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，制備成含生藥1 g/ml的濃縮液，除菌后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3實驗儀器 電子天平(Sartorius公司，型號：BSA3202S-CW)；小動物體重天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，型號：YP1002)；邁瑞B(yǎng)S-420全自動生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；雷杜酶標(biāo)儀RT-6100；高清成像系統(tǒng)；佳能(Canon)EOS 5D。

1.1.4實驗試劑 總膽固醇(TC)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號20190810)；三酰甘油(TG)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號20190810)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號20190810)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號20190810)；小鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(48T)(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號19101504)；小鼠IL-18 ELISA試劑盒(48T)(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號19082903M)；Anti-NLRP3抗體(美國Abcam，批號ab214185)；Anti-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1抗體(美國Abcam，批號ab138483)。

1.2方法

1.2.1分組與造模 將24只ApoE-/-小鼠隨機分為模型對照組、黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組、黃連溫膽湯高劑量組，以高脂飼料飼養(yǎng)4 w，構(gòu)建AS小鼠模型〔6～8〕。C57BL/6J小鼠6只為正常對照組，予以普通飼養(yǎng)喂養(yǎng)。

1.2.2給藥 ApoE-/-小鼠繼續(xù)高脂飼料飼養(yǎng)，并給予相應(yīng)藥物：黃連溫膽湯低劑量組予黃連溫膽湯〔9 g/(kg·d)〕，黃連溫膽湯中劑量組予黃連溫膽湯〔18 g/(kg·d)〕，黃連溫膽湯高劑量組予黃連溫膽湯〔36 g/(kg·d)〕。正常對照組繼續(xù)普通飼料飼養(yǎng)，并予等體積生理鹽水。每日灌胃1次。4 w后處死動物取材。

1.2.3檢測指標(biāo)

1.2.3.1血脂檢測 小鼠眼球靜脈叢取血，將離心管靜置于室溫2 h，待血液凝固成血塊收縮后，3 000 r/min離心10 min，取上清于離心管中，采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.2.3.2病理形態(tài)學(xué)觀察 蘇木素-伊紅(HE)染色：小鼠主動脈根部組織石蠟包埋，切片，脫蠟，覆水，蘇木素染液染色5 min，流水沖洗，1% 鹽酸乙醇分化3～5 s，返藍(lán)，0.5% 伊紅染液染色1 min，脫水封片。觀察后拍照。

1.2.3.3血清炎癥因子IL-1β、IL-18檢測 ELISA進行測定，操作過程中嚴(yán)格按照說明書步驟，將吸光度(A)值代入曲線方程中，計算出樣品的濃度并進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.4主動脈NLRP3、Caspase-1表達檢測 小鼠主動脈根部石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗3 min 3次，3%過氧化氫(H2O2)封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4℃冰箱中過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)振蕩清洗后分別滴加二、三抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片。觀察后拍照。采用Image-pro-plus 6.0對圖像進行分析。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組血清TC、TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，黃連溫膽湯高劑量組血清TC顯著降低(P<0.05)，黃連溫膽湯低、中劑量組TC有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型對照組比較，黃連溫膽湯低、中、高劑量組TG均顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，黃連溫膽湯中、高劑量組血清LDL-C顯著降低(P<0.05)，黃連溫膽湯低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型對照組比較，黃連溫膽湯低、中、高劑量組血清HDL-C差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠血清IL-1β、IL-18水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組IL-1β、IL-18水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組比較，黃連溫膽湯中劑量組和高劑量組IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)，黃連溫膽湯低劑量組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，黃連溫膽湯低、中、高劑量組IL-18水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血脂水平及血清IL-1β、IL-18水平比較(n=6，mmol/L)

2.3黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠主動脈根部病理形態(tài)學(xué)影響 主動脈根部HE染色顯示，正常對照組主動脈根部血管壁層次清晰，內(nèi)膜完整，無AS斑塊；模型對照組斑塊沉積最為明顯，管壁彌漫性增厚，斑塊脂質(zhì)核心大、數(shù)量多，可見大量泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶沉積，纖維帽細(xì)薄或不連續(xù)，中膜變薄，呈易損斑塊特征；各給藥組主動脈根部斑塊沉積程度有不同程度減輕。見圖1。

2.4黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠主動脈NLRP3、Caspase-1蛋白表達的影響 與模型對照組比較，黃連溫膽湯中劑量組和高劑量組主動脈斑塊中NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，黃連溫膽湯低劑量組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、圖3、表2。

圖1 各組主動脈根部(HE染色，×50)

圖2 各組主動脈根部典型病變區(qū)NLRP3(免疫組化染色，×60)

圖3 各組主動脈根部典型病變區(qū)Caspase-1(免疫組化染色，×60)

表2 各組主動脈NLRP3、Caspase-1蛋白 表達水平比較(n=4，IOD)

3 討 論

AS是冠心病、腦卒中等缺血性CVD的共同病理基礎(chǔ)，一直是心血管病領(lǐng)域研究的重點和熱點。AS發(fā)病機制復(fù)雜，2017年公布的CANTOS研究進一步論證和強化了炎癥反應(yīng)學(xué)說在AS發(fā)展中的核心地位，并首次證明了抗炎藥物可以減少CVD的發(fā)病風(fēng)險〔9〕。炎癥小體是新近發(fā)現(xiàn)的一類介導(dǎo)天然免疫的大分子蛋白復(fù)合體，NLRP3炎性體是目前研究最廣泛和最深入的炎癥體。當(dāng)膽固醇晶體、氧化低密度脂蛋白等激活NLRP3后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶前體(pro-Caspase-1)水解成為具有活性的Caspase-1，切割pro-IL-1β和pro-IL-18生成活性的IL-1β和IL-18，從而引起炎癥反應(yīng)；另外，NLRP3炎性體活化還能介導(dǎo)一種Caspase-1依賴性的促炎性程序性細(xì)胞死亡，即“細(xì)胞凋亡(pyroptosis)”〔10〕，從而促進炎癥反應(yīng)的擴散。2010年Duewell等〔11〕首次證明了NLRP3促AS作用；有研究報道AS患者主動脈中NLRP3表達顯著升高，且與冠狀動脈狹窄的嚴(yán)重程度及AS的危險因素呈正相關(guān)〔12〕，不穩(wěn)定性斑塊中NLRP3炎癥小體及IL-1β和IL-18在表達顯著高于穩(wěn)定斑塊〔13〕；均表明NLRP3炎癥小體途徑在AS發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并影響斑塊的穩(wěn)定性。干預(yù)NLRP3炎癥小體的激活有望成為AS防治的新靶點。目前已有動物實驗表明NLRP3抑制劑MCC950和Arglabin在AS小鼠中發(fā)揮顯著的抗炎和抗AS作用〔14，15〕，但尚未投入臨床，其可靠性、安全性及與人類相似性需研究者進一步深入研究。

中醫(yī)無“AS”相對應(yīng)的病名，常歸屬于“眩暈”“胸痹”“中風(fēng)”等范疇。中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會心血管病專業(yè)委員會血脂與AS學(xué)組制訂的《動脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》〔16〕，認(rèn)為AS屬本虛標(biāo)實之證，標(biāo)實涉及血瘀、痰濁、寒凝、氣滯、熱毒，本虛則為氣虛、陰虛、陽虛，受氣候、飲食、體質(zhì)等因素影響，痰熱互結(jié)是嶺南地區(qū)常見病機之一〔17〕。黃連溫膽湯首見于由清代陸廷珍編撰的《六因條辨》，藥物組成為黃連、半夏、茯苓、陳皮、枳實、竹茹、炙甘草、生姜，具有清熱燥濕化痰之效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃連溫膽湯具有抗AS、抑制炎癥反應(yīng)、降低血糖等作用。動物實驗表明黃連溫膽湯具有抗AS，對減少粥樣斑塊和穩(wěn)定粥樣斑塊均具有一定作用。本實驗采用高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠構(gòu)建AS易損斑塊動物模型，以NLRP3炎癥小體為切入點，探索其抗炎、抗AS的效應(yīng)機制。

本實驗結(jié)果顯示：黃連溫膽湯具有降脂作用，這可能為其抗AS作用機制之一。血清炎癥因子IL-1β、IL-18水平顯著降低，表明黃連溫膽湯具有降低全身炎癥反應(yīng)作用。本研究病理形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果表明黃連溫膽湯有穩(wěn)定主動脈易損斑塊的作用；免疫組化結(jié)果顯示黃連溫膽湯可能通過抑制主動脈組織中NLRP3炎癥小體的活化，降低炎癥因子IL-1β、IL-18的表達，從而發(fā)揮抗炎、抗AS的作用，為進一步深入研究黃連溫膽湯抗AS的作用機制奠定了基礎(chǔ)。