類風濕關節炎患者血清及關節滑液中Ghrelin和TNF-α水平的相關性

張金山 張 巖 趙 潔 李 臻 李 偉

1.第四軍醫大學基礎部人體解剖與組織胚胎學教研室，陜西西安 710032；2.第四軍醫大學唐都醫院風濕免疫科，陜西西安 710038

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種累及關節的慢性炎癥性疾病，以炎癥、關節滑膜增生和免疫功能異常為主要病理生理特征。RA病變呈持續性、反復發作性，造成關節進行性破壞，出現不同程度的功能障礙。RA的病因和發病機制迄今尚不明了，亦無針對性治療措施。近來的研究表明，自身免疫和非特異性炎癥反應是導致RA關節軟骨和骨質破壞的重要因素。Ghrelin是內源性增食欲肽，可調節攝食行為和能量代謝；Ghrelin具有抗炎作用，可下調促炎癥性細胞因子，在多種炎癥性疾病包括RA中其水平可發生變化[1-3]。TNF-α是炎癥發生和發展的關鍵性細胞因子，近10多年來TNF-α拮抗劑作為抗炎癥性藥物已用于RA患者的治療[4]。Gonzalez-Gay的研究發現，給重度RA患者靜脈灌注抗TNF-α單抗（infliximab）后血清Ghrelin水平顯著升高，說明阻斷TNF-α可促進機體內Ghrelin的分泌，TNF-α和Ghrelin在炎癥反應中具有相互調節作用[5]。本研究擬檢測RA患者血清和關節滑液中TNF-α和Ghrelin水平的變化，并分析兩者之間的相關性，為進一步探討RA的發病機制和治療策略提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇第四軍醫大學唐都醫院風濕免疫科收治的36例活動期RA患者，臨床診斷均符合美國風濕病學會1987修訂的RA分類診斷標準，其中男11例，女25例，平均年齡（48±12）歲，這些患者均無其他慢性病史，未接受過激素或免疫抑制劑治療。健康對照組36例為本院健康體檢者，男12例，女24例，平均年齡（42±11）歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集 RA組與正常組均于清晨8：00～9：00，空腹采取肘靜脈血5 mL，注入試管待凝固后，4℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-70℃冰箱保存待測。另對RA患者均接受膝關節外上方為穿刺點，用無菌注射器收集關節滑液4 mL。于2 000 r/min離心10 min，收集上清液，保存于-70℃冰箱保存待測。上述所有操作均在征得患者同意后實施。

1.2.2 血清和關節滑液Ghrelin水平測定 Ghrelin檢測EIA試劑盒購自ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories）公司，EIA法檢測的具體操作步驟按試劑盒說明書進行，主要程序如下：（1）空白孔內依次滴加標準品、血清或滑液樣品100 μL；（2）標準品或樣品孔中加入酶標記液50 μL，37℃孵育反應60 min；（3）洗板機清洗5次；（4）在標準品或樣品孔中加入底物A、B液各50 μL，37℃避光孵育反應15 min；（5）每孔加入終止液50 μL，終止反應；（6）混勻，用酶標儀檢測各孔的A值（450 nm濾色片）。

1.3 統計學分析

實驗數據均用（x ± s）表示，兩組間比較采用t檢驗；相關性檢驗采用Pearson分析法。采用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清和關節滑液中Ghrelin與TNF-α水平

Ghrelin與TNF-α水平檢測結果如表1所示，活動期RA患者血清Ghrelin水平顯著低于正常對照組（P＜0.05），而TNF-α水平明顯高于正常對照組（P＜0.01）；活動期RA患者關節滑液Ghrelin和TNF-α水平均顯著高于血清 （P＜0.05）。

2.2 RA患者血清與關節滑液中Ghrelin與TNF-α水平的相關性分析

RA患者關節滑液中Ghrelin與TNF-α水平呈負相關（r=0.819，P＜0.05）；而RA患者血清中Ghrelin與TNF-α水平相關性不顯著（r=0.364，P＞0.05）。

3 討論

慢性關節滑膜炎癥是RA的重要病理學特征，這種免疫性炎癥反應導致受累關節軟骨和骨的破壞，多種細胞因子參與了關節滑膜的炎癥反應，這些因子相互干擾、相互作用。Ghrelin是日本學者Kojima等[6]首先從胃黏膜分離純化的第一個生長激素促分泌劑受體的內源性配體，是一種含28個氨基酸的肽類激素。其主要功能是通過垂體生長激素促分泌劑受體刺激生長激素分泌，調節攝食行為和維持機體能量穩態。近來的研究表明，Ghrelin可調節炎癥和免疫反應，在炎癥反應中Ghrelin可下調促炎癥性細胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α），包括RA在內的多種炎癥性疾病中其水平可發生變化[1-5]。TNF-α是炎癥發生和發展的關鍵性促炎性細胞因子，TNF-α拮抗劑作為抗炎癥性藥物已用于RA患者的治療[4-5，7-8]。在免疫系統和代謝調節中TNF-α和Ghrelin的相互作用，外源性Ghrelin抑制LPS誘導的巨噬細胞TNF-α生成；TNF注射后小鼠血漿Ghrelin水平下降、并引起食欲降低，而同時注射Ghrelin可逆轉TNF-α的效應，這提示抑制TNF-α可增加體內Ghrelin分泌，促進攝食和改善營養狀況。先天性心臟病患兒血漿Ghrelin升高、并且與TNF-α水平呈正相關[9-11]。

本研究結果顯示，活動期RA患者血清中Ghrelin水平降低、TNF-α水平升高；首次觀察了RA患者關節滑液中Ghrelin水平，發現膝關節滑液中Ghrelin和TNF-α水平高于血清，且滑液中Ghrelin與TNF-α呈顯著負相關，這提示Ghrelin可能與TNF-α相互作用、共同參與RA的發生和發展進程。由于本研究未能獲取正常對照組的關節滑液，因而無法比較RA患者和正常人群關節滑液中Ghrelin的差異。進一步的研究應在RA動物模型上探討關節滑液中Ghrelin與炎癥性細胞因子的關系，以闡明Ghrelin在RA發生、發展中的作用及其病理生理學機制。

關于RA患者血循環中Ghrelin水平變化的研究結果尚存在一定爭議。Otero等[1]首先報道，RA患者血漿Ghrelin水平較正常對照明顯降低；而在福氏完全佐劑誘發的關節炎（AA）模型大鼠，7d時AA組大鼠血漿Ghrelin水平顯著低于對照組、15 d時恢復至對照組水平。Granado等[12]觀察了GHRP-2（一種Ghrelin激動劑）對大鼠AA的抗炎效應，發現AA大鼠血清Ghrelin水平升高，給予GHRP-2（100μg/kg）腹腔注射8 d后AA大鼠癥狀和患肢腫脹程度改善、降低關節炎評分和血清IL-6水平。而Koca等[13]的研究表明，RA患者血清總Ghrelin水平低于Behcet’s病患者和正常對照組，各組間酰基化Ghrelin水平差異無統計學意義；血清Ghrelin水平與RA患者的臨床和實驗室指標無顯著相關性。在ANCA-相關性脈管炎患者治療前血清Ghrelin水平是治療后的2倍，并且Ghrelin水平與疾病活動指標（包括C-反應蛋白）有關[14]。這些研究結果的不一致可能與所選病例、實驗條件和營養狀況等因素有關。抗TNF-α單抗（infflixmab）靜脈灌注120min后重度RA患者血清中Ghrelin水平顯著升高，并且伴有P-選擇素水平降低，說明阻斷TNF-α可促進機體內Ghrelin的分泌，從另一個層面證明Ghrelin可抑制促炎因子的合成與分泌[5]。青少年特發性關節炎患者血漿Ghrelin水平較對照組顯著降低，給予抗TNF-α治療后Ghrelin恢復至對照水平，并且患者Ghrelin水平變化與機體營養狀態、能量平衡和食欲等因素無明顯相關性，提示Ghrelin可能獨立于其他指標參與RA的發病，并與TNF-α共同調節RA的發生與發展。深入研究Ghrelin在RA發生中的作用及其與TNF-α的相互作用機制，有助于闡明類風濕關節炎發病的病理機制，為開發以Ghrelin為靶點的藥物治療骨關節炎癥性疾病提供理論基礎。

表1 兩組血清和關節滑液中Ghrelin和TNF-α水平比（x ± s，pg/m L）

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