腦源性神經營養因子與氨基糖苷類抗生素耳中毒

林墾 綜述 馬靜 張鐵松 阮標 審校

腦源性神經營養因子（brain－derived neuotrophic factor，BDNF）是1982 年德國神經生物學家Barde等從豬腦中分離出來的小分子蛋白質，是神經營養因子家族中的成員之一，該家族的其他成員還有NGF、NT3和NT4／5［1］。研究顯示，BDNF 對離體和在體聽神經受損傷神經元有存活和再生作用［2，3］，BDNF和NT3對來源于神經嵴和基板的感覺神經元殘存細胞有促進保護作用［4］。氨基糖苷類抗生素在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏陰性和陽性菌感染，但此類抗生素具有嚴重的耳毒性副作用，可使患者發生不可逆轉的聽力損失。已有研究證實BDNF是聽覺和前庭神經元發育過程中生存的關鍵營養因子，對成年豚鼠氨基糖苷類抗生素致聾有明顯的保護作用［5］。利用基因治療的途徑是目前感音神經性聾基礎研究領域中的重點課題。本文就腦源性神經營養因子與氨基糖苷類抗生素耳中毒方面的研究作一簡要綜述。

1 氨基糖苷類藥物耳毒性及其機制

1.1 氨基糖苷類抗生素在內耳的蓄積 與其他組織相比較，耳蝸中存在由微血管內皮細胞為主構成的血－ 迷路屏障結構，該屏障限制了氨基糖苷類抗生素通過的速度，致使內耳外淋巴液中藥物濃度上升及藥物消除緩慢［6］。氨基糖苷類抗生素在外淋巴液中的半衰期遠長于血液中的半衰期，這就造成了藥物在內耳淋巴液中的聚集，從而對前庭和耳蝸毛細胞產生毒性作用。不同部位的毛細胞攝取氨基糖苷類抗生素的順序不同，氨基糖苷類抗生素可長時間地停留在毛細胞內，構成氨基糖苷類抗生素損傷耳蝸聽覺功能和慢性損害的重要基礎［7］。

1.2 氨基糖苷類抗生素對內耳毛細胞的損傷 氨基糖苷類抗生素基本上被耳蝸內所有類型的細胞攝取，包括未被藥物損傷的細胞，除毛細胞外，還有基底膜下的間質細胞、Ⅲ型成纖維細胞都對氨基糖苷類抗生素都有高親和力，并在攝取后使藥物長時間潴留［8］。細胞的死亡可分為壞死和凋亡兩大類［9］。氨基糖苷類抗生素通過損傷毛細胞線粒體和溶酶體兩個途徑致毛細胞壞死［7］。氨基糖苷類抗生素在進入毛細胞后觸發了活性氧及JNK 酶的活性，導致了毛細胞線粒體內的細胞色素C 的釋放，激活了凋亡及核酸，并出現核固縮，最終出現毛細胞的壞死或凋亡［10］。陸文銓等［11］對豚鼠研究表明，耳蝸柯替器毛細胞凋亡與氨基糖苷類抗生素耳毒性的產生具有緊密的關系；同樣，柱細胞、Deiters以及螺旋神經節細胞和血管紋細胞也有存在凋亡現象。

1.3 氨基糖苷類抗生素對螺旋神經節神經元的損傷 組織學研究表明，氨基糖苷類抗生素可致動物耳蝸神經腫脹、脫髓鞘、樹突退行性變，同時觀察螺旋神經節細胞內神經微絲變化，核周體退變，線粒體層狀小體形成，甚至螺旋神經節細胞變性死亡［12］。王大君等［13］觀察硫酸慶大霉素對體外培養的小鼠的耳蝸神經節細胞生存數和細胞突起長度的影響，結果顯示硫酸慶大霉素對小鼠耳蝸螺旋神經節細胞的生存個數無明顯影響，提示氨基糖苷類抗生素對螺旋神經節細胞的影響可能是繼發性的。

鄧嘉虹等［14］觀察到慶大霉素對小鼠螺旋神經節神經元電生理特性的影響，結果顯示慶大霉素通過抑制螺旋神經節神經元細胞的鉀離子通道而產生耳毒性。此外，許多學者根據氨基糖苷類抗生素誘導的自由基損傷學說，在應用氨基糖苷類抗生素時，應用抗氧化劑或自由基清除劑，甚至基因治療來預防氨基糖苷類抗生素耳毒性的報告已有不少，但很少符合實際的臨床應用［15］。李明棟等［16］觀察到慶大霉素作用下豚鼠耳蝸螺旋神經節細胞凋亡相關蛋白bcl22 和Bax 的表達發生了顯著的變化，表明bcl22和Bax與慶大霉素誘導的螺旋神經節細胞凋亡密切相關，bcl22家族參與了慶大霉素誘導的耳蝸細胞凋亡。上述研究說明氨基糖苷類抗生素造成螺旋神經節細胞損傷的作用機制還無明確一致的結果，尚有待進一步研究證實。

2 BDNF對耳蝸的保護作用

BDNF通過抑制活性氧產物可達到對慶大霉素損傷的毛細胞的保護作用，與D－蛋氨酸、NG－硝基－L精氨酸甲酯（NG－nitro－L－arginie methy l ester，L－NAME）聯合使用其保護作用更強［17］。李鵬等［18］研究表明，轉染內耳的BDNF可保護外毛細胞，抑制順鉑對耳蝸聽功能的損害［18］。鄭國璽等［19］報道BDNF能減少毛細胞的死亡，對新生大鼠耳蝸毛細胞具有保護作用。目前就BDNF 對毛細胞的保護作用機制報道不多，但以上實驗表明神經營養因子確實可減少氨基糖苷類抗生素對毛細胞的損害，其機制還需進一步實驗予以證實。

活體實驗證實，BDNF 和NT3 mRNA 在平衡聽覺的神經移植中可以誘導神經軸突的生長［4］。相關實驗研究報道，BDNF 持續灌注豚鼠耳蝸后可對氨基糖苷類耳毒性藥物致聾后的螺旋神經節細胞胞體及樹突起保護作用，并且電聽覺反應的敏感性隨之相應提高［20］。Shinohara等［21］利用電極植入注有神經營養因子（BDNF和睫狀神經營養因子）的耳聾豚鼠耳蝸，發現神經營因子不僅提高了螺旋神經節細胞的成活率，更重要的是提高了聽覺系統對電刺激的反應性。這些結果都顯示，BDNF 和NT3（不包含NT5和NGF）是耳蝸和前庭神經元中最初營養保護因子。陳謙等［22］利用噪聲制備豚鼠耳聾模型，在噪聲損傷7d 后，通過圓窗膜注入以腺病毒為載體的重組Ad－BDNF，4周后，取耳蝸組織固定切片，進行BDNF 抗體免疫細胞化學染色和HE 染色，結果發現腺病毒介導的BDNF 基因可長期表達于內耳中，并且可在噪聲引起毛細胞死亡后有效地抑制聽神經元的退行性變。張青松等［23］研究豚鼠耳蝸在順鉑干預后螺旋神經節BDNF和NGF出現高表達，提示BDNF 和NGF 對順鉑誘導的螺旋神經元損傷有保護作用。朱綱華等［24］觀察腦源性神經營養因子基因修飾骨髓基質細胞對體外培養小鼠螺旋神經元的影響，結果顯示在體外BDNF 基因工程細胞能促進螺旋神經元的生長，并保護螺旋神經元免受氧化損傷。翟所強等［25］用腺病毒攜帶的神經營養因子注入噪聲損傷的耳蝸發現，BDNF 可有效地阻止和延緩螺旋神經元的退變。BDNF基因主要表達在耳蝸底回，這與它的受體表達部位是一致的，而NT3則與BDNF表達部位相反，正是這兩種神經營養因子的聯合作用在出生后的螺旋神經節細胞中起重要作用［26］。也有學者認為胚胎期的BD－NF主要表達在蝸尖，NT3表達在耳蝸底回，BDNF對中部和蝸尖的殘存的螺旋神經節細胞有支持作用［27］。同時，研究證明在螺旋神經節細胞成活和誘導周圍神經生長方面，幾種不同的神經營養因子聯合作用比單獨一種因子的作用要顯著［21］。聽泡中的BDNF和NT3mRNA 在誘導平衡神經節軸突向內生長的過程中及開始前的表達，都證明了NT3或者BDNF或者是兩者同時應用都可以用作早期神經纖維的生長誘導。其他結果也同樣證明這些神經營養因子在耳蝸和前庭神經元的以后研究中占據重要地位［4］。

3 BDNF對耳蝸的保護作用的可能機制

3.1 BDNF 和酪氨酸激酶B（tryosine kinase B，TrKB）在聽神經系統中的表達 發育成熟的人的BDNF序列與豬、鼠的BDNF 完全相同，而且與發育成熟的人的NGF、NT3和NT4／5約有50%的同源性［28，29］。BDNF和NT3及其受體對外毛細胞的分布起很重要作用［30］。在感覺上皮內，NT3和BDNFmRNA 在聽泡的特定區域有強表達，體外實驗證實BDNF在聽覺神經元中有強表達，NT3也有中等強度表達，在內耳的表皮細胞中含有這些神經營養因子的轉錄產物，聽覺神經元中有高水平的TrKB，中等水平的酪氨酸激酶C（TrKC）。在內耳的感覺上皮中缺乏明確的酪氨酸激酶S（TrKS）表達的方法，但其亞群在聽覺平衡系統中表達酪氨酸激酶A（TrKA）（約15%）、TrKB（約65%）和TrKC（約45%），它們協同組成部分神經營養素酪氨酸激酶（TrK）系統，但它們的具體作用仍然有待研究［31］。TrKB是癌基因TrK 編碼的BDNF 酪氨酸蛋白激酶受體，基因敲除動物實驗證實，BDNF 和TrKB基因敲除的小鼠約80%的耳蝸前庭神經元和Ⅱ型螺旋神經節細胞缺失［32］。進一步研究發現，NT3的轉錄產物出現在聽覺器官和前庭的不同感覺上皮細胞和支持細胞中，在這些感覺上皮細胞中，NT3的表達強度呈級度遞加，但是BDNF的表達限制在聽覺器官、前庭器官的感覺上皮細胞及壺蝮脊細胞中［4］。嚙齒類動物中，TrKB 基因能產生若干不同的轉錄物，其中有兩種mRNA 編碼全長或催化形式的TrKB，是介導BDNF 主要生物學活性的受體［33］。TrKB可以被BDNF和NT3激活，TrKC 產物有NT3的作用受體［4］。BDNF 與TrKB 高度特異性結合后可以快速產生自動磷酸化過程，而啟動細胞的轉錄實現其作用機制。

3.2 BDNF 對耳蝸的保護途徑 推測BDNF 對毛細胞的保護作用機制是抑制由慶大霉素及順鉑耳毒性產生的活性氧。BDNF與鈣蛋白酶抑制劑聯合使用對慶大霉素損害毛細胞的保護無增強輔助效應，因鈣蛋白酶抑制劑是抑制氨基糖苷類抗生素致毛細胞凋亡的作用，據此推測BDNF 可能不參與抑制毛細胞的凋亡［17］。

BDNF的神經營養作用非常廣泛，對外周和中樞的多種神經元具有營養作用，能夠維持多類神經元包括感覺神經元、運動神經元、膽堿能神經元、多巴胺能神經元、γ氨基丁酸（GABA）能神經元、小腦顆粒神經元等的存活并直接促進軸突生長。同時對維持聽神經元的發育和正常生理功能起重要作用。BDNF 對神經細胞的保護途徑主要是［34］：①通過調節細胞內鈣結合蛋白及其mRNA 水平，與細胞內鈣離子結合，促進鈣排出，保持胞內Ca2＋濃度的穩定性，從而保護神經元免受損傷；②BDNF 通過提高胞內抗氧化酶活性，對抗自由基以促進細胞損傷的修復。用BDNF 處理培養的神經細胞，可提高胞內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的濃度，降低谷氨酸（Glu）增高所致的自由基濃度增高；BDNF可提高谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性，抑制由于Glu所引起的Ca2＋濃度增高；③BDNF可以抑制興奮性氨基酸的細胞毒性。細胞損傷與興奮性氨基酸－Glu的過量釋放有直接關系。BDNF對調控NMDA 受體功能具有重要的作用，BDNF 可以通過減少NMDA 受體基因的表達，下調NMDA 受體的功能，抑制Glu的毒性。BDNF 還可以抵抗一氧化氮介導的Glu細胞毒性，以抑制興奮性遞質特別是Glu的釋放，減少細胞損傷；④BDNF可以抑制細胞凋亡。BDNF可通過調節轉錄因子等上游元件調節神經元內基因的表達，如c－fos、c－jun 等而抑制細胞凋亡、壞死的發生，這種效應可能是通過誘導TrKB 受體的表達增高來實現的。國內外目前關于腦源性神經營養因子與耳毒性關系的研究主要體現在對螺旋神經細胞的保護機制上，而對毛細胞的保護作用機制，以及氨基糖苷類抗生素對螺旋神經節細胞的作用機制都有待進一步探討。

4 研究展望

對耳蝸螺旋神經節的保護作用、對噪聲性聾的基因治療及對順鉑誘導的耳毒性保護作用都證實BDNF是內耳發生發展的重要營養因子。BDNF被認為是抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑、谷氨酸拮抗劑、抗氧化劑的這些作用在抗耳毒性作用中也必將起到重要作用。國外文獻報道神經營養因子對聽神經元的保護作用僅維持在持續給藥的治療期間［35］，也有報道腦源性神經營養因子的作用可維持到給藥后2周［36］。由于作用時間太短，很難應用于臨床。隨著研究的不斷深入，BDNF 在防護神經性聾方面也將從基礎研究逐步過度到臨床應用研究。根據實驗結果建議以細胞為基礎的神經營養因子治療方法，在臨床轉染治療過程中選擇包封技術來實現神經營養因子的傳遞，以減少和阻止感音神經性聾聽神經元的退行性變。如果與耳蝸植入后長期電極刺激結合應用，期望進一步提高聽神經元的存活率，以擴大和提高耳蝸植入的效果［37］。說明神經營養因子不僅可以作為直接的治療方式，還可以作為協同作用，進一步擴大了治療的適應證范圍，提高了現有治療方式的治療效果，為今后研究中選擇有價值的治療基因打下基礎，以便針對不同類型的感音神經性聾采取更合理的基因治療方式。

1 Isackson PJ，Huntsman MM，Murray KD，et al.BDNF mRNA expression is increased iadult rat forebrain after limbic seizures：temporal patterns of induction distinct from NGF［J］.Neuron，1991，6：937.

2 Lefebvre PP，Malgrange B，Staecker H，et al.Neurotrophins affect survival and neuritogenesis by adult injured auditory neurons in vitro［J］.Neuroreport，1994，5：865.

3 Staecker H，Kopke R，Lefebvre PP，et al.The effects of neurotrophins on adult auditory neurons in vito and in vivo.Proceedings of the 18th annual midwinter meeting［J］.Assoc Res Otolaryngol，1995，18：177.

4 Ulla P，Jucca Y，Jaan P，et al.Brain－derived neurotrophic factor and neurotrophin 3 mRNAs in the peripheral target fields of developing inner ear ganglia［J］.Developmental Biology，1992，89：9 915.

5 Chen Q，WangJ Z，Liu H，et al.Construction and characterization of recombinant adenoviruses expressing biologically active huamn brain－derived neurotrophic factor and neurotrophin－3［J］.Acta Biophysica Sinica，2000，16：511.

6 魏遠軍，張學淵.豚鼠耳蝸微血管內皮細胞的跨內皮細胞電阻及對牛血清蛋白的通透性［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2002，16：684.

7 高文元.氨基糖苷類抗生素耳毒性及其預防的研究進展［J］.中國眼耳鼻喉科雜志，2008，9.8.5，273.

8 Jing X，Andra ET，Jochen S.New developments in aminoglycoside therapy and ototoxicity［J］.Hearing Research，2011，281：28.

9 Bright J，Khar J，Khar A.Apoptosis：programmed cell death in health and disease［J］.Biosci Rep，1994，14：67.

10 Warchol ME.Cellular mechanisms of aminoglycoside ototoxicity［J］.Hearing Science and Vestibular Medicine，2010，18：454.

11 陸文銓，劉皋林.氨基糖苷類抗生素所致豚鼠耳毒性與耳蝸毛細胞凋亡的關系［J］.中國醫院藥學雜志，2007，27：65.

12 Leake PA，Hradek GT.Cochlear pathology of long term neomycin induced deafness in cats［J］.Hear Res，1988，33：11.

13 王大君，韓東一，楊偉炎，等.硫酸慶大霉素對小鼠耳蝸螺旋神經節細胞生長的影響［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，1998，12：55.

14 鄧嘉虹，梁傳余，廖大清.慶大霉素對小鼠螺旋神經節神經元電生理特性的影響［J］.聽力學及言語疾病雜志，2004，12：90.

15 Fetoni AR，Sergi B，Ferraresi A，et al.Alpha－Tocopherol protective effects on gentam ic in ototoxicity.an experimental study［J］.Int J Audiol，2004，43：166.

16 李明棟，劉兆華.慶大霉素作用下豚鼠耳蝸螺旋神經節細胞bcl22及Bax的表達［J］.重慶醫學，2006，35：65.

17 Takumida M，Anniko M，Shimizu A，et al.Neuroprotection of vestibular sensory cells from gentamicin ototoxieity obtained using nitric oxide synthase inhibitors，reactive oxygen species scavengers，brain－derived neurotrophic factors and calpain inhibitors［J］.Acta Otolaryngol，2003，123：8.

18 李鵬，謝景華，吳曉鐘，等.腺相關病毒介導腦源性神經營養因子拮抗順鉑耳毒性的研究［J］.臨床醫學，2010，30：92.

19 鄭國璽，祝康，韋俊榮，等.腺伴隨病毒介導的腦源性神經營養因子對耳蝸損傷保護作用的體外研究［J］.實用醫學雜志，2008，24：3 640.

20 蔡超，倪志立，張立松，等.耳蝸電刺激并腦源性神經營養因子聯合應用對大鼠耳蝸病理及聽覺生理的影響［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18：440.

21 Shinohara T，Bredberg GR，Ulfendahl M，et al.Miller neurotrophic factor intervention restores auditory function in deafened animals［J］.PNAS，2002，99：1 657.

22 陳謙，吳燕，郭維維.BDNF 基因對噪音引起的聽神經元損傷的保護作用［J］.解剖學報，2003，34：95.

23 張青松，葛圣雷，謝鼎華，等.腦源性神經營養因子和神經生長因子對順鉑誘導的內耳毒性的保護作用［J］.聽力學及言語疾病雜志，2006，14：130.

24 朱綱華，葛圣雷，謝鼎華.腦源性神經營養因子基因修飾骨髓基質細胞對體外培養小鼠螺旋神經元的影響［J］.聽力學及言語疾病雜志，2006，14：75.

25 翟所強，郭維，胡吟燕，等.腦源性神經營養因子對耳蝸螺旋神經節的保護作用［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，2002，37：109.

26 Crista LA，Michael AR，Robin LD.Opposite actions of brain－derived neurotrophic factor and neurotrophin－3on firing features and Ion channel composition of murine spiral ganglion neurons［J］.The Journal of Neuroscience，2002，22：1 385.

27 Farinas I，Jones KR，Tessarollo L，et al.Spatial shaping of cochlear innervation by temporally regulated neurotrophin expression［J］.J Neurosci，2001，21：6 170.

28 Hofer M ，Pagiusi SR，Hohu A，et al.Regional distribution of brain－derived neurotrophic factor mRNA in the adult mouse brain［J］.EMBO J，1990，9：2 459.

29 Rosenthal A，Goeddel DV，Nguyen T，et al.Primary structure and biological activity of hunman brain－derived neurotrophic factor［J］.Endocrinology，1991，129：1 289.

30 Rubel EW，Fritzsch B.Auditory system development：primary auditory neurons and their targets［J］.Annu Rev Neurosci，2002，25：51.

31 Catania S，Germana A，Cabo R，et al.Neurotrophin and TrK neurotrophin receptors in the inner ear of salmo salar and salmo trutta［J］.Anatomy，2007，210：78.

32 Ylikoski J，Pirvola U ，Moshnyakov M，et al.Expression patterns of neurotrophin and their receptor mRNAs in the rat inner ear［J］.Hearing Research，1993，65：69.

33 Dechant G，Rodrigue－Tehar A，Barde YA.Neurotrophin receptors［J］.Prog Neurobiol，1994，42：347.

34 侯莉娟，喬德才.腦源性神經營養因子的研究現狀［J］.中國康復醫學雜志，2005，20：9 410.

35 Shepherd RK，Coco A，Epp SB.Neurotrophins and electrical stimulation for protection and repair of spiral ganglion neurons following sensorineural hearing loss［J］.Hear Res，2008，242：100.

36 Agterberg MJ，Versnel H，van Dijk LM，et al.Enhanced survival of spiral ganglion cells after cessation of treatment with brain－derived neurotrophic factor in deafened guinea pigs［J］.J Assoc Res Otolaryngol，2009，10：355.

37 Lisa NP，Andrew KW，Marilyn SG，et al.Enhanced auditory neuron survival following cell－based BDNF treatment in the deaf guinea pig［J］.PLoS ONE，2011，6：18 733.