三種大豆分離蛋白的比較研究和物化特性相關(guān)性分析

范 媛，馬永強(qiáng)，袁美玲，李 丹

（1.哈爾濱米旗食品有限公司，哈爾濱 150060；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076；3.黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是以低溫脫溶大豆粕為原料生產(chǎn)的一種全價(jià)大豆蛋白，其蛋白質(zhì)含量在90%以上，是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動(dòng)物蛋白的品種之一。大豆分離蛋白除具有營養(yǎng)價(jià)值外，還具有許多重要的功能特性，如凝膠性、溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、粘性等，這些特性可有效地改善食品的口感，增加食品的彈性、保水性、吸油性，提高貯存性等[1]。大豆分離蛋白組成和結(jié)構(gòu)是決定其功能性的重要因素，近幾十年來備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注[2]。相關(guān)研究與工業(yè)化實(shí)踐的資料都顯示，不同生產(chǎn)企業(yè)的大豆分離蛋白在功能特性方面具有顯著差異，而這些差異主要是由于加工工藝條件的差異導(dǎo)致的[3]。

本研究選取了不同生產(chǎn)企業(yè)的大豆分離蛋白樣品，通過對(duì)其基本化學(xué)組成、表面基團(tuán)和功能性的研究，了解前2方面因素對(duì)功能性的影響，以期為進(jìn)一步探討上述影響奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料 3種大豆分離蛋白樣品分別由吉林省、黑龍江省和山東省的大豆蛋白生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 TGL-16G-B型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；722E型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；DZF-6020真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；NDJ-8S型數(shù)顯粘度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱：余姚市東方電工儀器廠；KDN-F自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)：常州國華電器有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀：英國Stable Micro Systems Ltd公司。

1.1.3 試劑 硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、甲基紅、亞甲基藍(lán)、十二烷基磺酸鈉、尿素、亞硫酸鈉等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的基本組成分析

（1）水分測定 水分含量測定采用直接干燥法。

（2）灰分測定 灰分測定采用干法灰化法。

（3）蛋白質(zhì)測定 采用凱氏定氮法。

（4）粗脂肪測定 采用索氏提取法。

1.2.2 蛋白表面基團(tuán)的測定

（1）蛋白表面巰基的測定 采用分光光度法測定[4]。

①溶液配制方法：

緩沖液A：8mol/L尿素，3mmol/L EDTA，l%SDS和0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）；

緩沖液B：10mmol/L DTNB，0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）；

緩沖液C：8mol/L尿素，3mmol/L EDTA，1%SDS，0.1mol/L Na2SO3，10mL/L NTSB和0.2mol/L Tris-HC1（pH9.5）；

緩沖液D：8mol/L尿素，3mmol/L EDTA，1%SDS，0.1mol/L Na2SO3，0.2mol/L Tris-HC1（pH 8.0）；

NTSB的制備：100mg的Ellment試劑溶解到10mL 1mol/L的亞硫酸鈉中，在38℃下通入氧氣直到亮紅色溶液變成淡黃色，就表明NTSB已經(jīng)生成。

②測定方法：直接用緩沖液A 20mL溶解0.100g大豆粉（1#），緩沖液D 20mL溶解0.100g大豆粉（2#），振蕩并使其全溶。用緩沖液A 20mL溶解一份處理過的豆?jié){（1#），緩沖液D 20mL溶解另一份處理過的豆?jié){（2#），震蕩并使其全溶。取1#溶液于紙型管中，分別測3次后取平均，在紙型管中分別加入0.1mL的緩沖液B，震蕩30min后加緩沖液A稀釋至3mL再測吸光度。以加緩沖液B而不加樣品為空白。取2#溶液于紙型管中，分別測3次，在紙型管中加入相同量的緩沖液C振蕩30min后加緩沖液D稀釋至3mL再測吸光度。以加緩沖液C而不加樣品為空白。

計(jì)算公式如下：

SH（μmol/g）=A412nm×D×10-6/C×V×13600

A412nm——吸光度；

D——稀釋倍數(shù)（對(duì)游離SH，D=（3/所取樣品溶液體積）×20；對(duì)總巰基，D=（3/所取樣品體積）×20）；

C——豆?jié){固形物含量，5mg/mL；

V——所取豆?jié){或牛奶的體積mL；

SS（μmol/g）=（總巰基含量-游離巰基含量）/2。

（2）表面疏水性的測定 采用SDS結(jié)合法測定蛋白質(zhì)表面疏水性。

①用尿素對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性，對(duì)改性SPI進(jìn)行冷凍干燥，研磨，過100目篩，測其表面疏水性。

改性方法：室溫配制8mol/L的尿素溶液。將SPI以1g 1003d110mL的比例加入到尿素溶液中，室溫?cái)嚢?h后冷凍干燥，制得常溫尿素變性大豆分離蛋白[5]。

②測定方法：取改性大豆分離蛋白，溶解于SDS溶液中，靜置30min，在pH為8的磷酸緩沖液中透析24h后取0.5mL透析液，加入10mL CHCl3，混勻后在CHCl3層中加入0.0024%的亞甲基藍(lán)溶液，充分混合，2500r/min離心15min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)混合物，于波長655nm處測其吸光度[6]。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：已知含量的SDS按上述測定方法測其吸光度，用1mg蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS的微克數(shù)來表示蛋白質(zhì)的疏水性。

1.2.3 大豆分離蛋白物化特性的測定

（1）測定大豆蛋白質(zhì)溶液粘度 將25g SPI樣品分散到500mL蒸餾水中，分散均勻后，靜置1h，再攪拌2min，80℃水浴60min，冷卻至25℃，再次攪拌2min，立即用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測定粘度。將旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)安裝于固定支架上，校準(zhǔn)水平，用直徑不小于70mm的直筒式燒杯盛裝樣液，并保持樣液恒溫，根據(jù)估計(jì)的被測樣液的最大粘度值選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子及轉(zhuǎn)速，裝好轉(zhuǎn)子，調(diào)整儀器高度，使轉(zhuǎn)子浸入樣液直至液面達(dá)到標(biāo)志處為止。接通電源，使轉(zhuǎn)子在樣液中旋轉(zhuǎn)，經(jīng)多次旋轉(zhuǎn)后指針趨于穩(wěn)定時(shí)或按規(guī)定的旋轉(zhuǎn)時(shí)間指針達(dá)到恒定值時(shí)，壓下操縱桿，同時(shí)中斷電源，讀取指針?biāo)甘镜臄?shù)值。如讀數(shù)值過高或過低，應(yīng)改變轉(zhuǎn)速或轉(zhuǎn)子，以使讀數(shù)在20～90之間，選擇4號(hào)轉(zhuǎn)子，0.6轉(zhuǎn)/min。

（2）乳化性與乳化穩(wěn)定性 在0.05mol/L pH7.0磷酸鈉緩沖液中配置1%的大豆分離蛋白溶液，加入大豆油（0.25L/L），均質(zhì)（10000r/min×10s）2次，形成均一的乳化液。均質(zhì)后，分別在0min和10min取1mL新制備的乳化液，用蒸餾水稀釋100倍，然后再取1mL被稀釋的乳化液，用0.1%SDS稀釋10倍，將最后溶液在500nm下進(jìn)行吸光值測定[7]。

A0——均質(zhì)后0min時(shí)被稀釋的乳化液的吸光值；

A10——均質(zhì)后10min時(shí)被稀釋的乳化液的吸光值；

t——時(shí)間（10min）。

（3）大豆分離蛋白凝膠性質(zhì)分析

①凝膠的制備：將蛋白質(zhì)溶于去離子水中，濃度為12%（w/v）， 攪拌均勻， 用分散器（Ultra-TURRAXT25）分散1min（12500r/min），均質(zhì)20MPa，將此蛋白質(zhì)溶液裝于100mL的燒杯中，蓋以鋁箔，將此燒杯置于90℃的水浴中加熱保溫30min，然后用冰浴冷卻至室溫，在4℃的冰箱中保存24h，從冰箱中取出立即測定其凝膠強(qiáng)度[8]。

②凝膠強(qiáng)度的測定：選用TA.XT2物性儀進(jìn)行測定，物性儀主要參數(shù)設(shè)定如下[9]：

運(yùn)行模式：TPA

數(shù)據(jù)采集速率：200pps

探頭：10mm圓柱型（P/0.5）

1.2.4 物化特性與蛋白組成及表面基團(tuán)的相關(guān)性分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行線性回歸分析。

2 數(shù)據(jù)分析與討論

2.1 原料的基本組成分析

大豆分離蛋白基本組成分析見表1。

2.2 蛋白表面基團(tuán)的測定

不同大豆分離蛋白巰基、二硫鍵含量及疏水性見表2。

計(jì)算公式如下：

表1 大豆分離蛋白基本組成分析 %

表2 不同大豆分離蛋白巰基、二硫鍵含量及疏水性

2.3 大豆分離蛋白物化特性的測定

2.3.1 大豆分離蛋白粘度測定 相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

2.3.2 大豆分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 相關(guān)數(shù)據(jù)見表4。

表3 不同大豆分離蛋白的粘度值

表4 不同大豆分離蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性

2.3.3 大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度測定 測定結(jié)果見附圖，相關(guān)數(shù)據(jù)見表5。

表5 凝膠性質(zhì)測定數(shù)據(jù)

2.4 數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

根據(jù)SPSS軟件分析顯示：

（1）建立粘度（Y）與各測定指標(biāo)之間的相關(guān)性，得到線性回歸方程為：

X1—水分；X2—灰分；X3—脂肪；X4—蛋白質(zhì)含量；X5—游離巰基；X7—二硫鍵含量。

根據(jù)軟件分析得出：粘度與蛋白質(zhì)含量、二硫鍵含量、游離巰基含量具有顯著的相關(guān)性。粘度與蛋白質(zhì)含量之間具有正相關(guān)性，大豆分離蛋白的粘度隨著蛋白質(zhì)含量增加而增加。大豆分離蛋白的表觀粘度隨蛋白質(zhì)濃度的增加呈指數(shù)型增加。這是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白的主要成分是大豆球蛋白和伴球蛋白，而球蛋白的軸比近于1，要使分子排列平行于流動(dòng)方向所需的能量遠(yuǎn)小于具有較高軸比的纖維狀蛋白質(zhì)。在后一種情況下，與流體流動(dòng)方向垂直的某些分子的取向增加流動(dòng)時(shí)的摩擦力。在較高濃度的蛋白質(zhì)溶液中即有類似的效應(yīng)發(fā)生。在這種情況下，一個(gè)分子周圍流動(dòng)模式的紊亂將會(huì)與另一個(gè)分子周圍的流動(dòng)模式紊亂發(fā)生相互作用或重疊，從而增加流動(dòng)時(shí)的摩擦力。大豆分離蛋白粘度隨濃度呈指數(shù)型增長的現(xiàn)象，是由上述效應(yīng)引起的。

粘度與二硫鍵含量之間具有正相關(guān)性，粘度隨二硫鍵含量增加而增強(qiáng)。二硫鍵含量增加導(dǎo)致分子間作用力加強(qiáng)，增加了分子間的摩擦力，導(dǎo)致粘度增加。

粘度與巰基含量之間具有負(fù)相關(guān)性，粘度隨巰基含量的增加而降低。巰基含量增加、二硫鍵含量減少導(dǎo)致分子間作用力減弱，減小了分子間的摩擦力，導(dǎo)致粘度降低。

（2）建立乳化性與各測定指標(biāo)之間的相關(guān)性，得到線性回歸方程為：

根據(jù)軟件分析得出：乳化性與蛋白質(zhì)含量具有顯著的相關(guān)性。

乳化性與蛋白質(zhì)含量之間具有正相關(guān)性，大豆分離蛋白的乳化性隨著蛋白質(zhì)含量增加而增強(qiáng)。蛋白質(zhì)分子中由于同時(shí)含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)這種特征結(jié)構(gòu)，因此具有乳化性，蛋白質(zhì)含量高時(shí)親水和親油基團(tuán)也隨之增加，因此乳化性也隨之增加。

（3）建立乳化穩(wěn)定性與各測定指標(biāo)之間的相關(guān)性，得到線性回歸方程為：

根據(jù)軟件分析得出：乳化穩(wěn)定性與各指標(biāo)之間相關(guān)性均不顯著。

（4）建立凝膠性與各測定指標(biāo)之間的相關(guān)性，得到線性回歸方程為：

根據(jù)軟件分析得出：凝膠性與蛋白質(zhì)含量、二硫鍵含量、游離巰基含量具有顯著的相關(guān)性。凝膠性與蛋白質(zhì)含量之間具有正相關(guān)性，大豆分離蛋白的凝膠性隨著蛋白質(zhì)含量增加而增加。大豆蛋白質(zhì)的濃度是凝膠能否形成的決定性因素之一。濃度為8.0%～16.0%的大豆蛋白質(zhì)溶膠，經(jīng)一定的加熱過程，冷卻后即可形成凝膠，濃度越高，凝膠強(qiáng)度越大。

凝膠性與二硫鍵之間具有正相關(guān)性，凝膠強(qiáng)度及性能隨二硫鍵含量增加而增強(qiáng)。加熱導(dǎo)致大豆分離蛋白變性分子形成，由大豆蛋白內(nèi)的二硫鍵、氫鍵、疏水鍵作用使解鏈的肽鏈間重新交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)從而形成了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此高含量的二硫鍵傾向于形成凝膠，從而導(dǎo)致凝膠性較好。

凝膠性與游離巰基含量之間具有負(fù)相關(guān)性，凝膠強(qiáng)度及性能隨巰基含量增加而減弱。巰基含量高時(shí)，二硫鍵含量隨之減少，導(dǎo)致肽鏈間重新交聯(lián)減弱，從而使凝膠強(qiáng)度降低。

3 結(jié)論

由表面特性分析可知：3種大豆分離蛋白中的游離巰基和二硫鍵含量由多到少的順序均為：樣品1>樣品2>樣品3。樣品2的疏水值高于樣品1和樣品3，說明處理后得到的樣品2蛋白質(zhì)表面疏水鍵暴露較多，疏水基含量較高，疏水性較強(qiáng)。通過SPSS軟件分析可知：大豆分離蛋白中粘度與蛋白質(zhì)含量、二硫鍵含量呈正相關(guān)、與巰基含量呈負(fù)相關(guān)；大豆分離蛋白的乳化性與蛋白質(zhì)含量、粘度、蛋白質(zhì)組成中7S組分含量呈正相關(guān)；大豆分離蛋白的凝膠性與蛋白含量、二硫鍵含量呈正相關(guān)，與巰基含量呈負(fù)相關(guān)。

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