穿琥寧注射液類過敏反應的實驗研究

李春英 梁愛華 趙雍 易艷 王云庭，2 李桂琴（中國中醫科學院中藥研究所，北京00700；2首都醫科大學中醫藥學院，00069）

穿琥寧注射液類過敏反應的實驗研究

李春英1梁愛華1趙雍1易艷1王云庭1，2李桂琴1（1中國中醫科學院中藥研究所，北京100700；2首都醫科大學中醫藥學院，100069）

目的：研究小鼠和大鼠對穿琥寧注射液的類過敏反應，為其臨床用藥提供參考。方法：①小鼠全身類過敏試驗：ICR小鼠隨機分組，分別一次性靜脈注射生理鹽水、Compound 48/80溶液或不同濃度穿琥寧注射液，以上受試物中均含0.4%伊文思藍。給藥后30min記錄各組動物耳廓藍染陽性率，進行耳廓藍染程度評分，并定量測定耳廓伊文思藍滲出量。②大鼠皮膚類過敏試驗：將大鼠背部和脊柱兩側的毛剃去，經尾靜脈注射含0.6%伊文思藍的生理鹽水溶液2m L/kg，10m in后，在麻醉條件下沿脊柱兩側皮內注射受試藥，每個點注射50μL。每只鼠均平行設有陰性對照點（生理鹽水50μL）和陽性對照點（Compound 48/80 500μg）。20min后，掀開皮膚觀察皮膚內藍斑形成情況，測量藍斑大小。結果：小鼠靜脈注射穿琥寧注射液50、100、200mg/kg（分別相當于臨床劑量的1/2、等倍和2倍劑量）均可引起小鼠類過敏反應，表現為耳廓血管通透性增高，耳廓不同程度藍染；大鼠皮內注射穿琥寧注射液50、100μg，可觀察到注射局部明顯水腫，形成較大的藍斑（與陰性對照組比較P<0.05）。結論：穿琥寧注射液對小鼠和大鼠均可引起顯著的類過敏反應，提示在臨床治療中具有潛在的類過敏反應的可能。

穿琥寧注射液；類過敏反應；實驗研究

穿琥寧注射液主要成分為穿琥寧 （14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內酯-3，19-二琥珀酸半酯單鉀鹽），主要用于病毒性肺炎、病毒性上呼吸道感染的治療。然而，近年來由于穿琥寧注射液導致的藥品不良反應不斷增多，其不良反應類型以急性過敏樣反應為主。從其不良反應發生的時間來看，多數發生在第1次用藥過程中或當天[1]，因此推測其不是免疫球蛋白（Ig）E介導的“過敏反應”（Ⅰ型過敏反應），而是“類過敏反應”。已知類過敏反應與Ⅰ型過敏反應的癥狀類似，但二者發生機制不同。“Ⅰ型過敏反應”需要有致敏過程，使機體產生IgE，再次用藥時才發生反應。而“類過敏反應”不需要致敏過程，首次接觸藥物即發生反應。關于類過敏反應的機制目前并不十分明確[2-3]。本研究利用前期已經建立的類過敏試驗動物模型，研究穿琥寧注射液的類過敏反應，為臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 動物

成年健康ICR小鼠，雄性，SPF級，體質量22～25 g，動物合格證號：0249028；成年健康SD大鼠，雌性，SPF級，體質量260～280g，動物合格證號：0243037。以上動物均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 藥品和儀器

穿琥寧注射液（天津藥業焦作有限公司，規格：2 m L/40 mg，批 號 ：09040341）；Compound 48/80（Sigma公司，批號：40M 4047）；伊文思藍（EB）（國藥集團化學試劑有限公司，批號：WC20070607）；丙酮（北京化工廠，批號：10100407）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號：110507406）；BHM 36Humalyzer 3000半自動生化分析儀（德國）。

2 方法

2.1 小鼠耳血管通透性試驗

將小鼠按體質量隨機分為5組：陰性對照組、Compound 48/80 25 mg/kg組、穿琥寧注射液50、100、200mg/kg組，每組10只。各組小鼠分別靜脈注射給予含0.4%EB不同受試物20 m L/kg，觀察給藥后30 m in內動物的行為學變化及耳廓藍染情況。記錄每組出現耳廓藍染的動物數、藍染總耳數、耳廓藍染面積。于注射受試物后30 min將動物脫頸椎處死。沿耳根剪下雙耳，剪碎，用2 m L丙酮-生理鹽水（7∶3）混合浸泡，置于 4℃冰箱浸泡過夜，萃取耳廓內滲出的染料。3 000 r/min離心15 m in，取上清液于610 nm處測吸光度（A）。根據EB標準曲線，計算EB染料滲出量（μg）。根據每組出現耳廓藍染的動物數計算耳廓藍染的陽性率（以下簡稱反應率）：

根據藍染耳數計算耳藍染率；根據EB滲出量與對照組比較計算出升高率；耳廓藍染面積（S）即藍染面積占耳廓面積的比按照以下標準進行分級：0分： 雙耳無藍染；1分：0＜ S≤1/8；2分：1/8＜S≤1/4；3分 ：1/4＜S≤1/2；4分 ：1/2＜S≤3/4；5分：3/4＜S≤1。

2.2 大鼠皮膚類過敏試驗

將大鼠背部和脊柱兩側的毛剃去。經尾靜脈注射含0.6%EB的生理鹽水溶液2m L/kg。于靜脈注射EB后10m in，在腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg使大鼠麻醉的條件下，沿脊柱兩側分別皮內注射陰性對照溶液（生理鹽水）、陽性對照溶液（Compound 48/80 500μg）、穿琥寧注射液 25、50、100μg，在每只大鼠上每種受試物分別注射2個點，每個點注射50μL。20 m in后，掀開皮膚觀察皮膚內藍斑形成情況，測量藍斑大小，直徑大于6 mm者判定為陽性。不規則斑點的直徑計算方法為長徑與短徑之和的一半。

3 統計分析

小鼠耳廓EB滲出量以及大鼠藍斑直徑數據均以x±s表示，采用One-Way ANOVA進行分析。每組反應率、耳藍染率均采用Fisher精確概率法與陰性對照組進行顯著性檢驗；耳廓藍染面積采用非參數檢驗。

4 結果

4.1 小鼠全身類過敏反應

從一般情況來看，陰性對照組動物均無異常。穿琥寧注射液200 mg/kg靜脈注射給藥后，小鼠迅速發生驚厥、跳躍、呼吸困難等嚴重類過敏癥狀，輔以胸外按摩得以存活。100 mg/kg組也出現不安、跳躍和呼吸困難癥狀。50 mg/kg組未見明顯行為異常。陽性藥（Compound 48/80 25mg/kg）對照組活動減少，未見驚厥、抽搐、呼吸急促或死亡等。

小鼠靜脈注射給予陽性藥Compound48/80 25 mg/kg后，所有動物均出現雙耳不同程度藍染，反應率和耳藍染率均達100%，耳廓EB滲出量明顯增高，與陰性對照組比較有顯著性差異（P<0.001）；穿琥寧注射液 50、100、200 mg/kg組可引起部分動物耳廓藍染，反應率分別為40%、20%、30%，與對照組比較均有不同程度升高，但無明顯劑量關系。對耳廓滲出的EB進行定量分析結果顯示，穿琥寧注射液各劑量組與對照組比較均有所升高，其中50 mg/kg組與對照組比較耳廓EB滲出量明顯增高（P<0.05）。結果見表1。

表1 穿琥寧注射液致小鼠耳廓血管通透性增高反應（n=10）

4.2 大鼠皮膚類過敏試驗

陽性藥Compound48/80 500μg組所有注射點均出現大面積藍斑，藍斑直徑平均達到19.40 cm，明顯大于對照組（P<0.001）；穿琥寧注射液 50、100μg組的藍斑陽性率直徑分別為70%、100%，與對照組比較陽性率顯著增高（P<0.05，P<0.001），藍斑直徑達到6.40、8.74 cm。與對照組比較均明顯增大（P<0.001）。結果見表2。

5 討論

血管通透性增高是類過敏反應的主要病理機制之一，由于血管通透性增高，血漿滲出到組織間隙，可引起組織水腫，顯現出皮膚、黏膜起疹、紅腫、瘙癢等；肺組織血管通透性增高及其炎性滲出，可導致咳嗽、喘息、呼吸困難等；嚴重類過敏反應時，由于大量血漿滲出，血容量下降，同時炎性因子導致毛細血管擴張，可引起血壓下降乃至休克等。本實驗室曾以血管通透性增高為指征建立注射劑小鼠類過敏反應模型，即在注射劑受試物中加入EB生理鹽水溶液，使EB濃度達到0.4%，然后給小鼠靜脈注射，由于EB是小分子物質，當其靜脈注射入血液后，很快與大分子白蛋白結合，當血管壁完整時，EB不會滲出到血管外，因而動物的耳廓不會出現藍染。但當血管壁通透性增高時，EB可隨著血漿中的白蛋白滲出到血管外，進入組織間隙，使血管外組織藍染。由于小鼠耳廓的皮膚很薄，耳廓藍染情況清晰可辨，所以可通過耳廓藍染發生率和耳廓藍染面積分級，判斷血管通透性增高的程度[4-6]。

表2 穿琥寧注射液致大鼠皮膚藍染情況（n=10）

大鼠靜脈注射給予EB，其與血漿中的白蛋白結合。從背部皮內注射給予不含指示劑的受試物，如果受試物不存在誘導血管通透性增高的作用時（如生理鹽水），則在注射部位局部形成藍色斑點很小（基本上直徑＜0.6 cm）。但是，如果皮內注射的受試物具有誘導血管通透性增高的作用時，則注射部位會由于血管通透性增高而導致局部水腫，因而形成較大面積的藍斑。根據藍斑直徑大小可判斷受試物的類過敏反應強度[7]。

一般認為類過敏反應具有劑量關系。在本研究中，穿琥寧注射液引起的小鼠類過敏反應癥狀與劑量成正比，高劑量組癥狀最重，中劑量組也有較明顯的癥狀，但比高劑量組輕；低劑量組的癥狀最輕。然而，從小鼠耳廓血管通透性增高結果看，穿琥寧注射液的反應劑量關系似乎不明顯，可能與劑量較高時動物的全身狀況較差有關。在大鼠皮膚類過敏試驗中，由于是局部給藥，并且給藥劑量較小，因此對全身的影響不明顯，穿琥寧注射液在該試驗中顯示出與劑量成正比。

本研究結果表明，穿琥寧注射液可引起較嚴重的類過敏反應，劑量較高時可導致呼吸困難和死亡。穿琥寧注射液的類過敏反應與血管通透性增高有一定關系，小鼠和大鼠實驗均可檢測出穿琥寧注射液誘導的血管通透性增高。但從小鼠的類過敏嚴重程度來分析，除了血管通透性增高以外，可能其他病理機制如肺組織氣道平滑肌痙攣對穿琥寧注射液的類過敏反應預后也起著重要作用。

在本研究中，穿琥寧注射液有造成小鼠耳廓血管通透性增高以及誘導大鼠皮內血管通透性增高的作用，該研究結果可以解釋穿琥寧注射液在臨床上的某些“過敏反應”癥狀，如皮膚起疹、瘙癢等。另外，根據實驗結果可知，劑量越高反應越重，甚至可危及生命，提示臨床上應嚴格控制用藥劑量，不可盲目加量。

類過敏反應的機制并不十分清楚，目前認為類過敏反應主要是由直接刺激肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺和類胰蛋白酶等或激活補體從而釋放上述生物活性物質這兩條主要途徑造成，而不是由經典的免疫途徑介導[8-9]。有關穿琥寧注射液的類過敏反應機制有待將來進一步研究。

[1]黃秋明，朱雯雯，趙君.172例穿琥寧注射劑不良反應文獻分析[J].藥物流行病學雜志.2008，17（2）：98-100.

[2]馬宏圖，睢鳳英.中藥注射劑安全性與類過敏反應[J].中國醫院藥學雜志，2009，29（10）：838-840.

[3]Robinson S，Sivanandan I.Anaphylactic and an aphylactoid reactions[J].An-aesth Intensive Care Med，2004，5（9）：298-300.

[4]梁愛華，李春英，劉婷，等.中藥注射劑的類過敏實驗動物模型和實驗方法研究[J].世界科學技術——中醫藥現代化，2010，12（6）：998-1004.

[5]李春英，梁愛華，高雙榮，等.嚙齒類動物類過敏試驗模型的建立[J].中國中藥雜志，2011，36（4）：488-491.

[6]趙克森，黃巧冰.血管通透性增高的基本機制[J].中國病理生理雜志，2003，19（4）：549-553.

[7]Nagy JA，Benjam in L，Zeng H，et al.Vascular permeability，vascular hyperpermeability and angiogenesis[J].Angiogenesis，2008，11（2）：109-119.

[8]Simons FER， Frew AJ， Ansotegui IJ， et al.Practical allergy（PRACTALL） report:risk assessment in anaphylaxis[J].Allergy，2008，63（1）：35-37.

[9]Szebeni J，Muggia F，Gabizon A，et al.Activation of complement by therapeutic liposomesand other lipid excipient-based therapeutic products:prediction and prevention[J].Adv Drug Deliv Rev，2011，63（12）：1020-1030.

The Experimental Study on Anaphylactoid Reactions of Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection

LiChunying1， Liang Aihua1， Zhao Yong1， YiYan1， Wang Yunting1，2， LiGuiqin1（1 Institute of Chinese Material Medica of China Academy of Chinese Medicine Sciences，Beijing 100700，China;2 School of Traditional Chinese Medicine of Capital Medical University， 100069）

Objective:To investigate the anaphylactoid reactions of potassium dehydroandrograpolide succinate injection（PDSI） inm ice and rats so as to provide a scientific guidance for its clinical therapy.Methods:①Anaphylactoid reaction test in m ice:ICR m ice were random ly assigned to receive intravenously physiological saline，compound 48/80 solution or different concentrations of PDSI respectively， containing 0.4%Evans blue（EB） .Thirty minutes later， the auricle aizen positive rate of each animal was recorded，the auricle aizen degree score and the quantitative determination of auricle EB seepage quantity were made.②Cutaneous anaphylaxis test in rats：rats were given physiological saline solution containing 0.6%EB by tail vein intravenous injection.Ten minutes later， 50μL solutions of PDSI in different concentrations were given to anesthetized rats by intra dermal injection on both sides of spine.Each rat is parallel with negative control point（physiological saline 50μL） and positive control point（compound 48/80 500μg）.Twenty minutes later，blue plaque in skin was measured and the absorbance of EB extraction of skin was quantitative determined.Results:The study of anaphylactoid reaction test in mice showed that all three doses of PDSI（50，100 and 200mg/kg，equivalent respectively to 1/2， 1 and 2 times of clinical doses） induced anaphylactoid reactions， as the vascular permeability increased and ear blue stained at different extent.The study of cutaneous anaphylaxis test in rats showed that PDSIata dose of 50 and 100mg/kg can induce edema at the injection site and form a larger locus blue plaque（vs.the negative control group， P<0.05）.Conclusion:It was proved thatanaphylactoid reactions can be induced evidently by PDSIboth in mice and rats，indicating that anaphylactoid reactions may happen in clinical therapy.

Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection；Anaphylactoid Reaction；Experimental Study

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.12.009

國家自然科學基金（90709043），國家科技支撐計劃項目（2006BAI14B05），國家科技重大專項（2009ZX09301-005，2009ZX09502-001）

李春英，女，助理研究員。研究方向：中藥藥理與毒理研究。E-mail:lcy121858@sina.com

梁愛華，女，博士，研究員，博士生導師。研究方向：中藥安全性評價、中藥毒性及其機理研究、中藥抗腫瘤、抗炎、免疫和內分泌調節作用及其作用機制研究。通訊作者E-mail:liangaihua@sina.com

2012-10-08）