新能量狀態下抗腫瘤光敏劑的研究

李 翀，卓先勤

(1三亞市人民醫院重癥醫學科，海南三亞572000;2瓊州學院理工學院，海南三亞572022)

0 引言

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)對腫瘤殺傷作用的基礎研究，近年來引起人們的高度重視.Survivin是近年新發現的一種腫瘤特異性凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，具有抑制凋亡效應蛋白酶caspase活性、參與細胞周期調控及調節細胞有絲分裂等多種生物學作用，與腫瘤的發生發展密切相關［1］.

在假定新能量狀態下光敏劑為有重大潛力光敏劑的基礎上，探討了新能量狀態下光敏劑產生單線態氧的能力及其產生的單線態氧對腫瘤細胞的殺傷能力，旨在為新能量狀態下光敏劑光敏劑的開發提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 新能量狀態下光敏劑

以文獻［2，3］的方法制備溶于5%二氯甲烷的甲醇溶液成1mg/ml新能量狀態下光敏劑儲液.

1.2 NADPH磷酸鹽重水緩沖液的配制［4］

將樣品配成2 mg/ml的二甲基亞砜溶液.稱取0.626gNa2HPO2·12H2O和0.0314gKH2PO4溶于適量水中，使總體積為100ml，即得pH7.4－7.8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液.稱取33.25 mg還原型輔酶Ⅱ鈉鹽加入上述磷酸鹽重水緩沖液，即為0.4 mmol/L NADPH磷酸鹽重水緩沖液.

1.3 新能量狀態下光敏劑在重水中對NADPH氧化作用的光動力敏化效應

將新能量狀態下光敏劑與適量NADPH磷酸鹽緩沖液混勻，使樣品濃度分別為1、2、3、4、5μmol/L，光源由高壓汞燈加濾光片(800 nm)獲得，然后在紫外分光光度計上于波長340 nm測定輻照后樣品溶液中NADPH殘留量.用同樣照光的不含NADPH而含等量同濃度樣品的磷酸鹽緩沖液作空白，以照光的不含樣品而含等量水的NADPH緩沖液作對照，測定各個樣品于不同濃度下NADPH剩余百分率，取3次測定的平均值，結果見表1.

1.4 細胞培養

用RPMI 1640(胎牛血清FCS含量10%)培養基培養傳代的腫瘤細胞，在細胞達指數相增長后，通過二倍稀釋法取一定量的細胞培養液，使用血細胞記數板確定細胞的濃度.

1.5 新能量狀態下光敏劑中新能量狀態下光敏劑濃度參數的探討

將新能量狀態下光敏劑儲液用5%二氯甲烷的甲醇溶液依次稀釋成20、10、5、3、1 μg/ml，作為新能量狀態下光敏劑參考濃度.

對腫瘤細胞進行新能量狀態下光敏劑－PDT處理的同時，以單純光照組、單純新能量狀態下光敏劑組為處理組的對照，并以未處理的細胞為空白對照.取密度為1×105個/ml的細胞，分別接種于96孔細胞培養板，每孔98 μl細胞液加入2 μl對應濃度得新能量狀態下光敏劑溶液，每一濃度設5個復孔，在CO2培養箱中暗作用3 h后，到光反應室照光50 min，繼續培養至24 h，每孔加入20 μl MTT，繼續于CO2培養箱中暗作用4 h后，輕輕吸取上清70 μl，加入DMSO 150 μl，混勻，至甲溶液中溶解，于酶聯檢測儀上測定各孔的OD490值.計算細胞的存活率:

細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%.

每孔重復計數3次取平均值.

2 結果與討論

2.1 D2O中新能量狀態下光敏劑對NADPH的光動力敏化效應

表1 鋅菌綠素在D2O中對NADPH光氧化作用的敏化效應

由表1可見，鋅菌綠素在重水中對NADPH具有較強的光氧化作用，在10 μg·ml－1時可以使90%以上的NADPH發生光氧化作用，提示鋅菌綠素具有較強的單線態氧產率.

2.2 不同新能量狀態下光敏劑濃度對腫瘤細胞存活率的影響

圖1 不同新能量狀態下光敏劑濃度對腫瘤細胞存活率的影響

由圖1可知，隨著新能量狀態下光敏劑濃度的增加，腫瘤細胞存活率呈明顯的下降趨勢.當新能量狀態下光敏劑濃度為10 μg/ml和20 μg/ml，腫瘤細胞的存活率分別為5.7%和5.2%，兩者之間無顯著差異.

3 討論

光動力療法治療腫瘤，臨床上已證實有確切療效，但其作用機理尚未完全闡明.一般認為，PDT主要通過一下三方面機制而達到治療腫瘤的作用［5］:(1)直接殺死腫瘤細胞，(2)破壞腫瘤組織內的血管，(3)免疫調節作用.如中國醫學科學院腫瘤研究所周傳農［6］研究員的課題組經十多年努力，認為光動力作用主要是通過微血管內皮細胞損傷和微循環障礙引起局部缺血、缺氧，導致腫瘤細胞的繼發死亡.

PDT是一種高選擇性腫瘤治療方法，通過光敏劑在腫瘤細胞中聚積，受光照后產生氧自由基達到殺死腫瘤細胞的目的，它具有毒性低，易重復治療等優點，氧化損傷是其主要的治療機制.但體內試驗中發現其機制遠較單純氧化損傷復雜，血管損害、凋亡等多種因素均參與其中.從研究中可以看出，鋅菌綠素具有高單線態氧產率并對腫瘤細胞具有高殺傷，提示單線態氧對細胞的殺傷作用在PDT機理中具有重要地位.

［1］許德余.光動力治癌藥物的歷史、現狀、進展、問題和前景［J］.中國激光醫學雜志，2009，10(1):44～47.

［2］王夢亮，常如波，劉滇生.金屬細菌葉綠素的合成及其抗腫瘤活性研究［J］.藥學學報，2005，40(10):920－923.

［3］M.Wendling，K.Lapouge，F.van Mourik，et al.Steady－state spectroscopy of zinc－bacteriopheophytin containing LH1 － an in vitro and in silico study.Chem.Phys，2011，275:31 －45.

［4］方勇，許德余，劉建飛.卟啉還原合成二氫卟吩及其光生物活性研究［J］.中國激光醫學雜志，2010，10(2):82－85.

［5］Kristjan Plaetzer，Tobias Kiesslich，Thomas Verbare and so on.The Modes of Cell Death Induced by PDT:An Overview［J］.Med.Laser.Appl，2003，18:7 －19.

［6］周傳農.國外光動力療法新進展——國際光動力學會第九屆年會簡介［J］.中國激光醫學雜志，2003，12(4):262－264.