燈盞花中燈盞花乙素的提取與高效液相色譜分析

許志剛，胡勁召，單法輝，楊保民，劉智敏，字富庭

(1.昆明理工大學理學院，云南 昆明650093;2.瓊州學院理工學院，海南 三亞572022)

0 引言

燈盞花為菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬的全草，性寒、味微苦，具有散熱解表、活血化瘀、通經活絡、消炎止痛等功效，臨床上用于心腦血管疾病、糖尿病腎病、肝硬化、皮膚病的治療［1］.其主要分布在云南、廣西、四川、貴州等地，由于自然分布的燈盞花數量有限，加之現代的大規模開發，野生燈盞花的數量已十分稀少.云南省已在楚雄、麗江、紅河等地進行大規模種植和研發，并將其列為重點開發中藥材.

燈盞花的主要有效成分為燈盞花素，包括燈盞花乙素和燈盞花甲素，兩者的化學結構式如圖1所示.燈盞花素中絕大多數為燈盞花乙素，燈盞花制劑廣泛應用于臨床，已有相關的藥理研究［2］、動力學研究［3］、生物有效性［4］、質量控制［5］、分析方法［6］等方面的報道.燈盞花乙素的提取方法有溶劑浸提法［7－8］、索氏提取法［9－10］、超聲提取［11］和微波提取［12］等.溶劑提取法具有操作簡便、快捷的特點.本文采用溶劑提取法制備燈盞花乙素提取液，優化提取條件，結合高效液相色譜進行定量分析，并對分析方法進行評價，該方法操作簡便、快速、穩定，適合燈盞花乙素的提取與快速分析.

圖1 燈盞花乙素和燈盞花甲素的化學結構式

1 實驗部分

1.1 儀器Dionex UltiMate－3000高效液相色譜儀，配備DAD檢測器和C18色譜柱(5 μm，4.6×250 mm);N－1001型旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司;TG16－WS臺式高速離心機，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司;BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司;SHZ－D(Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司;UPT－I－10超純水機，成都超純科技有限公司;Time ultrasonic超聲波清洗器，深圳市時代超聲設備有限公司;水浴回流裝置一套.

1.2 試劑燈盞花，購于昆明市菊花村中藥市場;燈盞花乙素標準品，購于貴州迪大科技有限責任公司;甲醇為色譜純;其他化學試劑為分析純;實驗用水為超純水，試樣在色譜分析前經0.45 μm濾膜過濾.

1.3 燈盞花乙素的提取及條件優化燈盞花的提取方法參考文獻［13］，燈盞花全株樣品破碎后過60目篩，用75%乙醇進行二次水浴回流提取，得到的二次提取液含有較多的雜質，這些雜質的存在可能會對燈盞花乙素的HPLC定性和定量分析帶來影響，所以試驗分別對除雜溶劑的種類和水沉除雜的時間進行了考察和優化.

1.4 色譜分析條件采用高效液相色譜對燈盞花乙素進行定量分析，流動相為甲醇:0.1%磷酸(v/v，40/60);流速0.9 mL/min，進樣體積均為20 μL;檢測波長335 nm，柱溫25℃.

2 結果與討論

2.1 提取條件優化

2.1.1 除雜溶劑優化取20 g燈盞花粉末，經水浴回流得到燈盞花的二次提取液200 mL，平均分成四份，分別用石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯對提取液進行萃取分離純化處理，萃取兩次，每次用量50 mL，收集水相，10000 r/min高速離心5 min，清夜用0.45 μm濾膜過濾，然后進行HPLC分析.經四種溶劑除雜后的色譜圖如圖2所示.結果表明:提取液經乙酸乙酯和正丁醇萃取純化后，干擾物質基本去除，但燈盞花乙素的含量也損失較多，對定量分析不利;氯仿和石油醚的除雜效果不佳，和不經溶劑除雜的效果基本一致.考慮到雜峰并不影響燈盞花乙素的定量分析，實驗采用燈盞花二次提取液直接進行色譜分析.

圖2 燈盞花提取液溶劑除雜效果對比圖

2.1.2 水沉時間優化

取10 g燈盞花粉末，經水浴回流得到的乙醇相燈盞花初提取液，旋轉蒸發至水相，加入約4倍的水定容，分別室溫放置0 h、24 h、48 h，進行水沉.水沉后水相旋轉蒸發，換75%乙醇作溶劑，10000 r/min高速離心5 min，清夜用0.45 μm 濾膜過濾，然后進行HPLC分析.比較其分離純化效果，色譜圖如圖3所示.結果表明:水沉處理具有一定的除雜效果，但水沉會損失大量的燈盞花乙素，不利于燈盞花乙素的定量分析.燈盞花損失可能是由于水沉過程析出固體可見物，吸附了溶液中的燈盞花乙素.因此，實驗中得到的提取液不經水沉處理.

圖3 水沉時間對燈盞花乙素含量的影響

2.2 燈盞花乙素標準品線性關系考察配制系列燈盞花乙素標準溶液，進行高效液相色譜分析，繪制峰面積－濃度標準曲線，線性方程為Y=0.955+1.11X，相關系數 r=0.9999，線性范圍為0.10 －500 mg/L，檢出限為7.0 μg/L.

2.3 高效液相色譜法測定燈盞花乙素含量準確稱取1 g燈盞花樣品，按照優化的方法進行提取，并進行高效液相色譜分析，通過建立的色譜方法進行定量分析，得到燈盞花樣品中燈盞花乙素的含量為1.0%，平行測定5次，相對標準偏差RSD為3.0%.

3 結論

通過75%乙醇回流提取的方法制備燈盞花提取液，并經過除雜溶劑和水沉時間的優化，建立了燈盞花樣品中燈盞花乙素的快速、簡便的提取方法，結合高效液相色譜實現定量分析，方法的線性方程為Y=0.955+1.11X，相關系數 r=0.9999，線性范圍為 0.10 －500 mg/L，檢出限為 7.0 μg/L，燈盞花樣品中燈盞花乙素的含量為1.0%，平行測定5次的相對標準偏差為3.0%.該方法操作簡便、快速、穩定，適合燈盞花乙素的提取與快速分析.

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