M3受體激動劑膽堿對大鼠心肌細胞內鈣離子的影響

欒海蓉，李海林，何志鵬，吳 紅

(牡丹江醫學院機能學教研室，黑龍江省高校腫瘤疾病防治重點實驗室，黑龍江牡丹江157011)

心臟M3受體具有重要的生理功能和病理意義，在充血性心力衰竭、缺血性心律失常等疾病的發生、發展中發揮重要作用［1］。近期研究表明，激動M3受體對心肌缺血及H2O2誘導的心肌細胞凋亡有保護作用，可以減少離體細胞中烏頭堿和毒毛花苷誘導的細胞內鈣超載，對烏頭堿和氯化鋇誘發 Wistar大鼠心律失常的發生和發展具有保護作用［2-4］。

激動M3受體可以介導IKM3電流，使鉀離子通道開放，促進鉀離子外流，引起心肌細胞膜的超極化，縮短動作電位時程，導致Ⅱ期平臺期縮短，間接使鈣離子內流減少，心肌細胞［Ca2+］i降低。M3受體還可以通過Gq/11激活磷脂酶 C，使膜結合的二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解為三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油，兩者作為細胞內第二信使，均可以使心肌細胞［Ca2+］i增加。以上兩個通路作用結果使細胞內鈣變化截然相反，因此，該研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡技術，分別利用高鉀激活細胞膜電壓依賴性鈣通道，引起外鈣的內流，以及咖啡因和IP3激活心肌細胞內“鈣池”內質網/肌漿網引起細胞內鈣的釋放，觀察M3受體激動劑膽堿對心肌細胞胞質游離鈣離子濃度的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年Wistar大鼠，雌雄兼用，體質量250～300 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品和儀器 4-羥乙基哌嗪乙磺酸［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES］，乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸［ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid，EGTA］，Na2-ATP，小牛血白蛋白(BSA)，膠原酶Ⅱ，實驗藥物膽堿和4-DAMP(4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine-methiodide)等購自 Sigma公司;Fluo-3/AM，F-127等購自Invitrogen公司，日本Olympus FV-300激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.3 溶液配制 包括［5］臺氏液:NaCl 126 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，MgCl2110 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用NaOH調pH至7.35。無鈣臺氏液除沒有CaCl2之外，其余成分與臺氏液相同。細胞保存液(KB液):Glutamic acid 70 mmol/L，Taurin 15 mmol/L，KCl 30 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，KH2PO410 mmol/L，MgCl20.5 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用 KOH 調 pH 為7.3～7.4。

1.4 大鼠單個心室肌細胞的制備 將大鼠撞擊頭部致昏，仰臥位固定于鼠臺上，迅速開胸取出心臟，置于4℃臺氏液中，游離主動脈并逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上，臺氏液8 mL/min流速連續灌流約5 min，洗去心臟殘血，然后用無鈣臺氏液灌流約10 min至心臟停搏后，用含0.02%膠原酶Ⅱ的無鈣臺氏液灌流分離豚鼠單個心室肌細胞，消化約10 min后自左心室分段剪取心室肌組織，置于盛有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個細胞，棄除大塊組織，置于 4℃冰箱穩定1 h待用［6-7］。

1.5 熒光染料的配制與細胞染色 取穩定好的細胞，用20 μmol/L的Fluo-3/AM染色，在37℃恒溫水浴中孵育45 min，去除負載液后，用正常臺氏液再洗滌1次，最后將細胞用正常臺氏液稀釋到所需濃度。取染好色的細胞置于浴槽中，靜置貼壁5 min后用于實驗，光鏡下選取桿狀、橫紋清晰無顆粒的細胞實驗［8］。細胞內鈣的增加以熒光強度(fluorescence intensity，FI)升高表示。

1.6 細胞內鈣離子(［Ca2+］i)變化的檢測 在Time seriesXYT模式下掃描記錄心肌［Ca2+］i，激發波長為488 nm，掃描時間程序設定為每10秒采集一次數據，連續采集30次。基礎熒光值按最小噪聲最大圖像信號設定，預掃描獲得基礎值后于第2次和第3次掃描間隙之間加入終濃度為30.0 mmol/L KCl，平均熒光強度以給藥后與給藥前的熒光強度比值(FI/FI0)表示。

1.7 統計學方法 圖像分析時，細胞內基礎鈣FI定為1.0，加藥后鈣FI的變化為其相對值，以均數±標準差(±s)表示，統計學處理采用方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膽堿對靜息狀態下大鼠心肌細胞內鈣熒光強度的作用 在正常臺氏液(含Ca2+1.8 mmol/L)加入膽堿5.0 mmol/L 和 4-DAMP 2.0 nmol/L，對照組加相同體積0.9%的生理鹽水，鈣Fmax/FI0無明顯改變(表1)。

表1 膽堿對靜息狀態下心肌細胞鈣熒光強度的影響

2.2 膽堿對咖啡因介導Rynaodine受體激動所致大鼠心肌細胞內“鈣池”Ca2+釋放的影響 在無鈣臺氏液(含 EGTA 2.0 mmol/L)中，加入終濃度10.0 mmol/L的咖啡因可使細胞內熒光強度比值(FI/FI0)增加(2.53±0.24)倍(峰值處)(n=20，與靜息值相比，P＜0.01)。10.0 mmol/L Rynaodine受體的拮抗劑普魯卡因(procaine)孵育心肌細胞15 min，可以抑制咖啡因誘導的心肌細胞內鈣FI/FI0的增強。5.0 mmol/L膽堿預先孵育細胞15 min后再用咖啡因激動，內鈣升高倍數無明顯改變(表2)。

10.0mmol/L咖啡因使得心肌細胞內FI/FI0增高達到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿不能使FI/FI0降低(圖1)。

表2 膽堿對咖啡因誘導心肌細胞內鈣釋放鈣熒光強度的影響

圖1 choline對Caeffni和IP3誘導的細胞內鈣釋放的影響

2.3 膽堿對IP3介導IP3受體激動所致大鼠心肌細胞內“鈣池”Ca2+釋放的影響 在無鈣臺式液中，加入終濃度10.0 mmol/L IP3使細胞FI/FI0增加(1.81±0.24)倍(n=20，與靜息值相比，P ＜0.01)。測定前預先用IP3受體的拮抗劑肝素(heparin)孵育心肌細胞15 min，肝素可以抑制IP3誘導的心肌細胞內鈣FI/FI0的增強。5.0 mmol/L膽堿預先孵育細胞15 min后，不能抑制IP3誘導細胞內鈣熒光強度的增強(表3)。

10.0mmol/L IP3使得心肌細胞內FI/FI0增高達到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿不能使FI/FI0降低(圖1)。

表3 膽堿對IP3誘導心肌細胞內鈣釋放鈣熒光強度的影響

2.4 膽堿對KCI誘導大鼠心肌細胞內鈣熒光強度增高(外鈣內流)的影響 在正常臺氏液(含1.8 mmol/L Ca2+)中加入30 mmol/L KCl后，［Ca2+］i逐漸升高，FI/FI0增加(2.62 ±0.11)倍(n=20，與靜息值相比，P ＜0.01)。10.0 μmol/L 鈣拮抗劑維拉帕米(verapamil)孵育心肌細胞15 min，可以抑制KCl心肌細胞內鈣FI/FI0的增強。當細胞用5.0 mmol/L膽堿預孵15 min后加入KCl，可以明顯降低鈣FI/FI0至(1.42 ±0.13)倍(n=30，與 KCl相比，P ＜0.01)。而細胞用5.0 mmol/L膽堿與2.0 nmol/L 4-DAMP共同預孵 15 min后加入 KCl，FI/FI0恢復至(2.24±0.12)倍(n=30，與膽堿相比，P ＜0.01)(圖 2A)。30.0 mmol/L KCl使得心肌細胞內FI/FI0增高達到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿可使FI/FI0明顯降低(圖2B)。

圖2 膽堿對KCI誘導大鼠心肌細胞外鈣內流的影響

3 討論

Ca2+在生命活動中起著至關重要的作用，是影響或決定許多細胞反應和活性的第二信使。細胞內Ca2+的調節主要包括兩方面:跨膜鈣轉運和胞內鈣池的調節。跨膜鈣轉運包括質膜鈣通道、質膜鈣泵和Na+/Ca2+交換。胞內鈣池的調節則包括胞內鈣池Ca2+-ATP酶、胞內鈣池鈣結合蛋白、胞內鈣池受體鈣通道的調節。其中，通過心肌細胞膜電壓依賴性L-鈣離子通道的“外鈣內流”和心肌細胞內鈣釋放通道IP3R和RyR介導的“內鈣釋放”在調節心肌細胞內游離鈣離子的穩定水平發揮著最重要的作用［9］。

實驗結果表明，M3受體激動劑膽堿對靜息狀態下的細胞內鈣的濃度無影響，說明膽堿不參與自發的外鈣內流和內鈣釋放，不影響靜息狀態下的心肌細胞對鈣離子的調節。

細胞內鈣池貯存鈣的釋放主要是由Ryanodine受體系統和IP3受體系統介導，它們均是受體依賴性鈣通道。本實驗采用咖啡因激動心肌細胞Ryanodine受體和IP3激動IP3受體，從而引起心肌細胞［Ca2+］i的增加。結果表明，不論是前給藥還是后給藥，膽堿均不能拮抗咖啡因和IP3介導胞內鈣熒光強度的升高，表明膽堿對心肌細胞內鈣池內儲鈣的釋放沒有影響。

本實驗中，采用30.0 mmol/L KCl誘導心肌細胞膜上的電壓依賴性鈣通道被激活，L-型鈣通道開放，外鈣內流，使得［Ca2+］i明顯升高。分別采用膽堿孵育細胞預先給藥，和先用KCl增高［Ca2+］i然后加入膽堿后給藥兩種方式，結果表明膽堿均可以拮抗KCl誘導心肌細胞外鈣內流的作用，說明膽堿可以阻斷細胞膜L-型鈣通道，從而減少鈣內流。4-DAMP是M3受體特異性阻斷劑［10］，2.0 nmol/L 4-DAMP 能恢復 5.0 mmol/L膽堿抑制的KCl除極誘導的心肌［Ca2+］i升高，提示該作用可由M3受體調節。

實驗結果表明，雖然M3受體介導的“IKM3”通路和“Gq/11”通路對細胞內鈣離子作用相反，但實驗結果表明，M3受體激動劑膽堿可以通過阻斷細胞膜L-型鈣通道，從而減少鈣內流，降低心肌細胞內總鈣濃度，抑制鈣超載，從而對缺血性心肌發揮保護作用。

［1］岳朋，呂延杰，楊寶峰.心臟M3受體作為抗心律失常藥物新靶點研究的［J］.藥學學報，2006，41(8):702-705.

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［6］王赫，周宇宏，單宏麗.冬蟲夏草水提液對單個心室肌細胞鉀通道的影響［J］.中國藥理學通報，2004，20(5):536-539.

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