Exonuclease-1缺失延緩端粒酶缺失小鼠造血微環(huán)境的衰老

石桂英，林培容，白 琳，鞠振宇

（1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2北京華信醫(yī)院，北京 100016）

人類衰老過(guò)程中的一個(gè)重要表現(xiàn)是各器官再生能力及穩(wěn)態(tài)維持能力的降低，這與衰老過(guò)程中成體干細(xì)胞功能下降有關(guān)［1-3］。細(xì)胞微環(huán)境的變化可以影響成體干細(xì)胞功能［4］，而環(huán)境變化會(huì)影響再生醫(yī)學(xué)中干細(xì)胞移植的應(yīng)用。目前，衰老過(guò)程中干細(xì)胞微環(huán)境變化的分子機(jī)制尚不明確。研究表明，端粒酶基因突變和端粒縮短是人類衰老和骨髓衰竭性疾病發(fā)生的重要原因之一［5，6］。端粒酶缺陷小鼠的建立為研究端粒與人類衰老的機(jī)制提供了重要的模型動(dòng)物。Exonuclease-1（Exo-1）是一種核酸外切酶，是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵點(diǎn)基因［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)Exo-1缺失延長(zhǎng)了端粒酶基因缺陷小鼠的壽命［8］。然而，在第三代Terc和Exo-1雙基因敲除小鼠（G3 Terc-/-Exo-1-/-）小鼠中，不但小鼠的整體環(huán)境是雙基因敲除，而且造血干細(xì)胞也是雙基因敲除。為進(jìn)一步明確，Exo-1基因敲除對(duì)端粒酶缺陷小鼠骨髓造血系統(tǒng)的影響是通過(guò)改善造血干細(xì)胞微環(huán)境來(lái)起作用的，我們通過(guò)骨髓移植實(shí)驗(yàn)，然后分析野生型供體造血干細(xì)胞在不同受體微環(huán)境中的功能，來(lái)研究Exo-1對(duì)端粒酶缺失小鼠造血微環(huán)境衰老的影響。

1 材料和方法

1.1 Exo-1、Terc雙基因敲除小鼠

Exo-1基因敲除小鼠由德國(guó)引進(jìn)，Terc基因敲除小鼠及CD45.1小鼠由美國(guó)Jackson Laboratory引進(jìn)。Exo-1、Terc雙基因敲除小鼠本實(shí)驗(yàn)室繁育。動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2009-0007。

G3 Terc-/-及G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠在3～4月齡時(shí)，接受4.5Gy放射線照射，4 h內(nèi)眼后注射野生型CD45.1小鼠全骨髓細(xì)胞，約250μL，含1×107細(xì)胞，移植后一周給予抗生素預(yù)防感染。

1.2 基因敲除小鼠的基因型鑒定

用2周齡小鼠尾尖堿裂解法提取基因組DNA，PCR鑒定基因型。TERC敲除小鼠鑒定引物為：mTRR：5＇-TTCTGACCACCACCAACTTCAAT-3＇，5PPgK：5＇-G GGGCTGCTAAAGCGCAT-3＇，mTRW tF：5＇-CTAAG CCGGCACTCCTTACAAG-3＇。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 m in；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 m in。野生型片段為250bp，TERC敲除片段為180 bp。Exo-1敲除小鼠鑒定引物為：Primer A：5＇-CTTCGCTTTATGAAGC AGCC-3＇，Primer B：5＇-AGGAGTAGAAGTGGCGCG AAGG-3＇，Primer C：5＇-AGGAAAGAGTCAGAGTGC TGGC-3＇。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 m in。野生型片段為318 bp，Exo-1敲除片段為349 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL（試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司）。

1.3 制備單細(xì)胞懸液

移植用骨髓細(xì)胞取自2～3月齡CD45.1小鼠。小鼠脫頸椎處死后，無(wú)菌條件下，剝離后腿骨肌肉，用冰上預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗骨髓腔，獲得全骨髓細(xì)胞，定容至10 m L，50μm濾膜過(guò)濾，混勻后，取10 μL細(xì)胞，稀釋10倍，計(jì)數(shù)。水平轉(zhuǎn)子離心，1000 rpm，10 m in，棄上清，加適量染色緩沖液，調(diào)整至需要濃度。

移植后的受體小鼠在9月齡時(shí)安樂(lè)死后，剝離后腿骨肌肉，用冰上預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗骨髓腔，獲得全骨髓細(xì)胞；胸腺研磨成細(xì)胞懸液；脾臟縱切成兩半后，一半研磨成細(xì)胞懸液，一半用10％福爾馬林固定，進(jìn)行HE染色。上述細(xì)胞懸液，50μm濾膜過(guò)濾，混勻后，取10μL細(xì)胞，稀釋10倍，計(jì)數(shù)。水平轉(zhuǎn)子離心，1000 rpm，10 m in，棄上清，加適量染色緩沖液，調(diào)整至108細(xì)胞/m L。

1.4 標(biāo)記抗體

外周血細(xì)胞30μL，加入CD4-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PE-Cy7、CD11b-APC、CD8-APC-Cy7混合液，冰上靜置30 m in，加1 m L PBS，離心，2600 rpm，5 m in，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，50μm濾膜過(guò)濾，備流式分析。

骨髓細(xì)胞中髓系染色抗體為B220-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、Gr1-PE-Cy7、CD11c-APC、CD11b-APC-Cy7；B系淋巴細(xì)胞染色抗體為IgD-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PE-Cy7、IgM-APC、CD43-Biotin、SA-APC-Cy7。染色時(shí)先加入CD43-Biotin，冰上靜置30 m in，加1 m L PBS，離心，2600 rpm，5 min，棄上清，再加入其它抗體混合物，冰上靜置30 min，加1 m L PBS，離心，2600 rpm，5 min，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，50μm濾膜過(guò)濾，備流式分析。

2 結(jié)果

2.1 Exo-1缺失改善骨髓造血干細(xì)胞的微環(huán)境

為研究Exo-1對(duì)骨髓微環(huán)境的影響，我們分析了骨髓中供體來(lái)源的B淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，以及B淋巴細(xì)胞的發(fā)育情況。流式分析結(jié)果顯示，G3Terc-/-Exo-1-/-小鼠骨髓中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.04），而CD11b+Gr1+的髓系細(xì)胞比例低于G3 Terc-/-小鼠，但差別無(wú)顯著性（P=0.1216）；對(duì)不同發(fā)育階段的B淋巴細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠骨髓中供體來(lái)源的Pre B細(xì)胞的比例明顯高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.01274），而成熟B細(xì)胞的比例明顯低于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0004）（見(jiàn)圖1）。這說(shuō)明Exo-1缺失改善了骨髓造血干細(xì)胞的微環(huán)境，從而使供體來(lái)源的野生型小鼠骨髓造血干細(xì)胞正常分化。

2.2 Exo-1缺失改善脾臟B細(xì)胞發(fā)育成熟的微環(huán)境

為研究Exo-1對(duì)脾臟微環(huán)境的影響，我們對(duì)受體小鼠中供體來(lái)源的脾臟細(xì)胞進(jìn)行分析。流式分析結(jié)果顯示，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠脾臟中B220+細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P= 0.001），而CD11b+Gr1+細(xì)胞的比例下降，但差異無(wú)顯著性（P=0.1268）（見(jiàn)圖2）。這說(shuō)明Exo-1缺失改善了脾臟細(xì)胞的微環(huán)境，從而使野生型小鼠脾臟細(xì)胞正常發(fā)育成熟。

2.3 Exo-1缺失改善胸腺T細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境

為研究Exo-1對(duì)胸腺微環(huán)境的影響，我們對(duì)受體小鼠中供體來(lái)源的胸腺細(xì)胞進(jìn)行了分析。對(duì)胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠胸腺細(xì)胞總數(shù)明顯高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0024）。對(duì)胸腺細(xì)胞的流式分析結(jié)果顯示，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠胸腺中CD4、CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0428），見(jiàn)圖3。這說(shuō)明Exo-1缺失改善了胸腺細(xì)胞的微環(huán)境，從而使T淋巴細(xì)胞在胸腺中正常發(fā)育分化。

2.4 外周血細(xì)胞分析

圖2 供體來(lái)源的脾臟細(xì)胞分析圖Fig.2 Analysis of donor derived spleen cells注：A：脾臟中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞及CD11b+細(xì)胞流式分析圖；B：脾臟中供體來(lái)源的CD11b+Gr1+細(xì)胞流式分析圖；C：脾臟中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞和CD11b+ Gr1+細(xì)胞所占比例Note：A：representative FACS plot of B220+cells and CD11b+cells in donor derived splenocyte；B：representative FACS plot of Gr1+cells and CD11b+cells in donor derived splenocyte；C：percentage of donor derived B220+cells and CD11b+Gr1+cells in spleen

外周血中各種細(xì)胞的比例反應(yīng)了骨髓和脾臟的造血能力，以及骨髓造血干細(xì)胞的多系分化能力。本研究對(duì)小鼠外周血流式分析結(jié)果顯示，G3 Terc-/-Exo-1-/-受體小鼠外周血中供體來(lái)源的B淋巴細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-受體小鼠（P= 0.04，見(jiàn)圖4）。這說(shuō)明Exo-1缺失改善造血干細(xì)胞的微環(huán)境，從而使供體來(lái)源野生型小鼠骨髓造血干細(xì)胞正常發(fā)育分化，維持外周血中各種血細(xì)胞比例的穩(wěn)定。

圖3 供體來(lái)源的胸腺細(xì)胞流式分析圖Fig.3 Analysis of donor derived thymus cells注：A：胸腺中供體來(lái)源的T淋巴細(xì)胞流式分析圖；B：胸腺細(xì)胞總數(shù)；C：胸腺中供體來(lái)源的CD4、CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例Note：A：representative FACS p lot of CD4+and CD8+T lymphocyte cells in the thymus； B：number of total thymus cells；C：percentage of donor derived CD4，CD8 double positive cells in the thymus

3 討論

本研究中應(yīng)用端粒功能障礙引起的衰老小鼠G3 Terc-/-小鼠和G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠為受體，CD45.1小鼠為供體，分離骨髓細(xì)胞后，進(jìn)行骨髓移植。在受體小鼠9月齡時(shí)取小鼠骨髓、脾臟、胸腺等組織器官進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-14/-小鼠骨髓細(xì)胞中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞的發(fā)育得到改善，在骨髓細(xì)胞中所占比例高于G3 Terc-/-小鼠，而且PreB細(xì)胞在B220+細(xì)胞中的比例明顯升高，可見(jiàn)Exo-1缺失改善了骨髓細(xì)胞的環(huán)境，延緩了骨髓微環(huán)境的衰老，從而使供體來(lái)源的骨髓造血干細(xì)胞能夠正常發(fā)育分化（見(jiàn)圖1）。對(duì)脾臟的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠脾臟供體來(lái)源的B220+細(xì)胞的比例顯著高于G3 Terc-/-小鼠（P= 0.001），可見(jiàn)Exo-1缺失改善了脾臟細(xì)胞環(huán)境（見(jiàn)圖2）。Exo-1缺失改善環(huán)境的作用在胸腺發(fā)育中更為明顯，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠的胸腺細(xì)胞總數(shù)明顯多于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0024）；從細(xì)胞發(fā)育來(lái)看，G3 Terc-/-小鼠供體來(lái)源的CD4、CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯降低，Exo-1缺失改善了這種狀況，在G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠中供體來(lái)源的雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯升高（見(jiàn)圖3）。對(duì)外周血的分析也得出同樣結(jié)果，即G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠外周血中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞明顯高于G3 Terc-/-小鼠小鼠（見(jiàn)圖4）。綜上可見(jiàn)，Exo-1缺失改善了端粒酶缺失小鼠的細(xì)胞微環(huán)境，延緩了造血系統(tǒng)微環(huán)境的衰老，從而使植入的野生型骨髓造血干細(xì)胞正常發(fā)育分化。

圖4 供體來(lái)源的外周血細(xì)胞分析圖Fig.4 Analysis of donor derived peripheral blood cells注：A：外周血中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞及CD11b+細(xì)胞流式分析圖；B：外周血中供體來(lái)源的B220+細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞所占比例Note：A：representative FACS p lot of B220+cells and CD11b+cells in the donor derived peripheral blood；B：percentage of donor derived B220+cells and CD11b+cells in the peripheral blood

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