耐頭孢菌株的糖尿病腎病臨床特點的研究

周小年 藍文 覃志偉 李紅斌

耐頭孢菌株的糖尿病腎病臨床特點的研究

周小年 藍文 覃志偉 李紅斌

目的 研究耐頭孢他啶的糖尿病腎病患者對β-內酰胺酶(EsBIJs)攜帶情況及對常用抗菌藥物的耐藥情況。方法 篩選出耐頭孢他啶的菌株，PCR擴增基因TEM、SHV、CTX-M。進而進行對頭孢他啶、慶大霉素、環丙殺星、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦和亞胺培南的藥敏性檢驗。結果 有89%糖尿病腎病患者出現耐頭孢他啶的情況，在耐頭孢他啶菌株中有68%表現產ESBLs陽性菌對頭孢類抗生素高度耐藥，對慶大霉素、環丙殺星的耐藥率為69% ～88%，對頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20%～30%，對亞胺培南高度敏感(100%)。結論 耐頭孢他啶的糖尿病腎病患者易攜帶β-內酰胺酶基因，并表現多重耐藥性。

糖尿病腎病;頭孢菌素;ESBLs;亞胺培南

糖尿病及其慢性并發癥已嚴重影響人類健康和生活質量。近年來，糖尿病發病人數呈上升趨勢。糖尿病腎病(DN)是糖尿病的重要并發癥之一，已成為導致終末期腎衰竭的首位疾病［1］。在糖尿病腎病的臨床治療中，第3代頭孢菌素的使用呈逐年上升的趨勢，這是由于第3代頭孢菌素類藥物對β-內酰胺酶高度穩定，血漿消除半衰期內分布廣，組織穿透力強，對腎臟基本無毒性，且制劑類多，選擇種類較多，適合各年齡段患者，始終是應用中的首選［2］。隨著三代頭孢菌素的廣泛應用，糖尿病腎病患者易發生產ESBIJs菌的耐藥問題，所以臨床分離產ESBIJs細菌對指導臨床合理應用抗生素、抑制新產生的耐藥菌等均有十分重要的意義［3］。本實驗針對頭孢菌素類藥物耐藥的DN患者進行觀察，分析耐藥機制，同時探討其臨床特點，并提出合理的治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取1年以上使用第三代頭孢菌素的300位糖尿病腎病患者為研究對象，收集患者血液和尿液，放在水解酪蛋白胨(M-H)瓊脂培養基，購自杭州天和微生物試劑有限公司。然后挑取菌落，制備菌株。

1.2 抗生素紙片 頭孢他啶、慶大霉素、環丙沙星、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 耐頭孢他啶的藥敏實驗 將從患者體內分離的菌株，用抗菌藥物紙片擴散法即K-B法和MIC法測定對頭孢他啶的藥敏情況。將菌株對頭孢他啶抑菌環直徑≤15 mm或MIC≥6μg/ml的菌株，歸為不敏感菌株。

1.4 ESBIJs篩選試驗 雙紙片協同實驗，參照NCCLS(2009年版)，按常規紙片擴散法在M-H上涂好菌株。先在平板中心貼阿莫西林紙片，然后在其上下左右貼CAZ、ATM、FTX、FEP，周圍紙片距中心紙片距離25 mm，35℃孵育18～20 h。如周圍4個藥敏中有任何一個與阿莫西林有協同作用為ESBIJs陽性菌株。

TEM基因PCR反應參數為94℃預變性5min，然后94℃lmin，55℃ 1 min，72℃ l min，30 個循環，再 72℃10 min。SHV基因PCR反應參數為94℃預變性5 min，94℃ 30 s，退火 68℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30 個循環，再72℃10 min。CTX一M基因PCR反應參數為94℃預變性3 min，然而94℃ 45 s，56℃45 s、72℃1 min，32 個循環，再 72℃ 5 min。PCR 產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察結果。

1.6 對常用抗菌藥物的耐藥情況 對表型為ESBIJs陽性菌株，分別進行對常見藥物亞胺培南、慶大霉素、環丙沙星、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏試驗，方法如同耐頭孢他啶的藥敏實驗。

1.7 儀器FQD-33A熒光定量PCR檢測系統購自杭州博白公司。

2 實驗結果

2.1 耐頭孢他啶菌株陽性率 用抗菌藥物紙片擴散法即KB法和MIC法測定從患者體內分離的菌株對頭孢他啶的藥敏情況。發現在300例患者中有267例，即89%的DN患者均對頭孢他啶耐藥。

表1 患者耐頭孢他啶菌株陽性率(例，%)

2.2 TEM、SHV、CTX一M基因PCR檢測結果 在267例耐頭孢他啶的DN患者，進行產ESBIJs陽性菌的篩選。為了進一步的確認產ESBIJs陽性菌。用PCR擴增ESBIJs酶中常見的3種TEM、SHV、CTX-M 基因，TEM和SHV基因擴增均出現相同條帶(1 074 bp)，CTX一M基因出現217 bp清晰明亮產物帶。發現TEM、SHV、CTX-M基因的檢出率分別為52.3%、43.3%和68.7%。有72株菌株同時檢測到2種以上基因型。見圖1～3。

圖1 TEM基因1074 bp片段瓊脂凝膠電泳圖

圖2 SHV基因1074 bp片段瓊脂凝膠電泳圖

圖3 CTX-M基因217 bp片段瓊脂凝膠電泳圖

2.3 藥敏試驗結果 由表2的實驗結果得出，產ESBIJs菌對頭孢類抗生素高度耐藥，對慶大霉素、環丙殺星的耐藥率為69% ～88%，對頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20% ～30%，對亞胺培南高度敏感(100%)，產ESBIJs菌表現出多重耐藥性，除了對亞胺培南的耐藥率很低以外，對其常見的抗生素均表現耐藥交叉性。

表2 產ESBIJs菌對常見抗生素的耐藥率(例，%)

3 討論

糖尿病腎病DN是糖尿病嚴重的慢性并發癥，DN的發病是多因素綜合作用的結果。近年來，由于廣譜頭孢菌素在糖尿病腎病臨床治療中的廣泛應用，患者對頭孢菌素的耐藥率有增加的趨勢。如何合理使用抗菌藥物，盡可能減少抗菌藥物的毒副作用，減少二重感染及細菌耐藥性的發生，一直備受廣大臨床工作者的關注。據相關文獻報道［4］，超廣譜β-內酰胺酶(EsBIJs)，能水解包括三代頭孢菌素、單環酰酶胺類抗生素和四代頭孢菌素等含1個氧亞氨基基團側鏈的β-內酰胺(0xyimino B-lactam)類抗生素，但可被β-內酰胺酶抑制劑(克拉維酸)等抑制。所以本實驗首先篩選出耐頭孢他啶的DN患者。發現在300例患者中有267例，即89%的DN患者均對頭孢他啶耐藥。

ESBIJs耐藥基因種類較多，包括TEM型、SHV型、CTXM型等，其中以TEM和SHV型為主，但在中國以CTX-M型為主。本實驗對篩選出的耐頭孢他啶的患者進行ESBIJs表型及其基因分析。通過ESBIJs篩選試驗，發現267例患者中，有187例，即70%的患者表現ESBIJs陽性特征。然后通過PCR擴增TEM、SHV、CTX一M基因，進一步確認產ESBIJs的陽性患者［5］。發現 TEM、SHV、CTX-M 基因的檢出率分別為52.3%、43.3%和68.7%。有72株菌株同時檢測到2種以上基因型。見圖1～3。

然后對ESBIJs表型陽性的菌株進行其他常見抗菌藥物的藥敏檢驗。由實驗結果得出，產ESBIJs菌對頭孢類抗生素高度耐藥對慶大霉素、環丙殺星的耐藥率為69%-88%，對頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20%-30%，對亞胺培南高度敏感(100%)，產ESBIJs菌表現出多重耐藥性，除了對亞胺培南的耐藥率很低以外，對其常見的抗生素均表現耐藥交叉性。因為ESBIJs常位于質粒上，可以從一個細菌傳遞到另一個細菌，甚至在不同的菌種之間傳遞［6］。因此，產ESBIJs細菌的耐藥性與攜帶多個耐藥基因的質粒、ESBIJs基因型及細菌本身固有的耐藥機制有關。產ESBIJs細菌常表現出對多種抗菌藥物的同時耐藥，常同時對第三代頭孢菌素，喹諾酮類及氨基糖苷類藥物耐藥。而碳青霉烯類抗生素，包括亞胺培南、美洛培南等，在體內與體外對ESBIJs都高度穩定，是治療產ESBIJs菌株嚴重感染療效確切的一類藥物［7］。喹諾酮類藥物耐藥基因常位于染色體上，最近研究顯示喹諾酮類藥物耐藥基因和ESBIJs編碼基因可位于同一個可轉移性的質粒上。產ESBIJs細菌的質粒上還往往連鎖攜帶了耐氯霉素、磺胺類、四環素、氨基糖苷類等的耐藥基因［8］。

如何合理使用抗菌藥物，盡可能減少抗菌藥物的毒副作用，減少二重感染及細菌耐藥性的發生，一直備受廣大臨床工作者的關注［9］。隨著三代頭孢菌素的廣泛應用，產ESBIJs菌引起的耐藥問題越來越嚴重，對臨床分離產ESBIJs細菌的監測成為臨床微生物檢驗十分重要的內容，對指導臨床合理應用抗生素、有效治療革蘭陰性菌引起的嚴重感染性。疾病、醫院內感染的控制、抑制新產生的耐藥菌等均有十分重要的意義。

［1］舒士敏，徐麗，張玉璞，李宜，張英澤.糖尿病腎病治療近況.實用糖尿病雜志，2005，13(05):53-54.

［2］孫惠娟，張衛同，陳海濱.頭孢菌類抗生素應用分析.中國現代醫學雜志，2006，16(13):2059-2061.

［3］邵劍春，胡大春，楊紹敏，周玲，李超，劉德華.產ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的檢測及其基因分析.國外醫學(臨床生物化學與檢驗分冊)，2005，26(12):872-876.

［4］管希周，劉又寧，王睿.臨床產ESBIJs細菌耐藥特性及其基因分型的研究.中國抗生素雜志，2001，26(6):468-472.

［5］梁陳方，蔣利君，韋曉謀.第三代頭孢菌素的用藥頻度與耐藥現狀分析.中國藥物與臨床，2005，5(03):192-194

［6］彭少華，吳瓊，聶署萍.耐亞胺培南銅綠假單胞菌產OXA型β內酰胺酶分型.中國感染與化療雜志，2007，7(04):295-298.

［7］朱衛民，錢元恕.β-內酰胺酶動力學研究進展及臨床意義.國外醫藥(抗生素分冊)，1998，10(06):445-451.

［8］Deinum J，Tarnow L，Van Gool JM，etal.Plasma renin and prorenin and rennin gene variation in patientswith insulin dependent diabetesmellitus and nephropathy Neprhrol Dial Transplant，1999，14:1904-1911.

［9］Solini A，Vestra MD，Saller A，The angiotensin converting enzyme DD genotype is associated with glomerulopathy lesions in type2 diatetes Diatetes，2002，51:251-255.

415000 湖南省常德市石門縣人民醫院