高效液相色譜法測定大鼠血漿中的二氯二茂鈦

杜建紅 李云蘭 李青山

高效液相色譜法測定大鼠血漿中的二氯二茂鈦

杜建紅 李云蘭 李青山

目的建立反相高效液相色譜法測定大鼠血漿中有機金屬抗癌原料藥二氯二茂鈦的含量。方法采用Shimadzu VP-ODS色譜柱(250×4.6mm，5m)，V(甲醇)∶V(醋酸銨)=55∶45，pH 2.5為流動相，流速為1.0ml/min，紫外檢測波長254nm，柱溫室溫，氨基比林為內標進行測定。血漿中生物樣品采用液-液萃取法進行提取。結果二氯二茂鈦在大鼠血漿中的線性范圍為10～120μg/ml，回歸方程為Y=57.83X-0.6042(r=0.9991，n=7)，方法精密度RSD為1.8%(n=6)，平均回收率為RSD=1.63%(n=9)。結論方法簡單快速，專屬性強，可用于測定大鼠血漿中二氯二茂鈦的含量，為該類藥物的體內血藥濃度檢測和動力學研究提供了實驗依據。

二氯二茂鈦;反相高效液相;血漿;含量測定

二氯二茂鈦作為一種新型有機金屬抗癌化合物，對實體瘤具有很強的抑制作用，而且毒副作用較小，國內外對其作用機制進行了大量研究［1，2］，已進入二期臨床研究。由于其溶解性特殊，其分析測試方法比較困難，除已有的定量測定方法分光光度法、電勢滴定法、氧瓶燃燒法［3］和正相高效液相色譜法［4］等，還建立了反相高效液相色譜法研究［5］，本文在前期方法研究的基礎上對血漿中二氯二茂鈦原料藥進行了分析，為該類藥物的體內血藥濃度檢測和動力學研究提供了實驗依據。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑 島津LC-2010A液相色譜儀(帶紫外檢測器);LC-Solution色譜工作站;Precisa 92SM-202A-DR-SCS型電子分析天平;榮泰80-1型離心沉淀機;KQ-500DB型數控超聲波清洗機(工作頻率為40KHz，超聲電功率為500W)。

二氯二茂鈦為本實驗室自制;對照品(以氯仿為溶劑3次重結晶，純度≥99.9%);內標氨基比林對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);甲醇為色譜純，其他均為分析純。

1.2 實驗動物 Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～250g，山西醫科大學實驗動物中心提供。

2 血漿中二氯二茂鈦測定方法的建立

2.1 色譜條件 Shimadzu VP-ODS色譜柱(250×4.6mm，5μm);流動相為甲醇-醋酸銨(55∶45，v/v)，流速為 1.0ml/min;檢測波長:254nm;柱溫:室溫;進樣量:20μl。

2.2 對照品與內標溶液的制備 對照品溶液 準確稱取干燥至恒重的二氯二茂鈦對照品適量，用甲醇溶解制備成含二氯二茂鈦為200μg/ml對照品貯備液，于4℃冰箱中密閉保存。

內標溶液準確稱取干燥至恒重的氨基比林適量，用甲醇配制成200μg/ml的內標貯備液，于4℃冰箱中密閉保存。臨用時，精密吸取即可。

2.3 血漿樣品的處理及測定方法 于1.5ml具塞試管中加入大鼠空白血漿樣品200μl，加甲醇0.2m l，旋渦混合3min，-4℃離心10min(l0000r/min)。吸取上清夜20μl注入液相色譜儀，依上述色譜條件分析，得空白血漿色譜圖，見圖1(a)。

于1.5m l具塞試管中加入大鼠空白血漿樣品200μl，二氯二茂鈦對照品溶液100μl(200μg/ml)，混勻后，加甲醇0.2ml，旋渦混合 3min，-4℃離心 10min(l0000r/min)。分層后，吸取有機相于1ml尖底試管中，通N2氣流揮干，殘渣用甲醇800μl溶解，吸取上清夜20μl注入液相色譜儀，依上述色譜條件分析，得血漿中對照品色譜圖，見圖1(b)。

將內標溶液與樣品加入空白血漿中，依上述色譜條件分析，得血漿中內標與樣品色譜圖，見圖1(c)。

圖1 高效液相色譜圖

3 結果

3.1 線性關系實驗 取大鼠空白血漿200μl置于帶塞尖底試管內，加入100μl的二氯二茂鈦標準系列溶液，使最終濃度為 10，20，40，60，80，100，120μg/ml。按“血漿樣品的處理及測定方法”處理上述樣品，建立標準曲線。分別以待測物與內標峰面積比為橫坐標，以生物樣品中待測物的濃度為縱坐標，求得直線回歸方程:Y=57.83X-0.6042(r=0.9991)，線性關系良好。

3.2 精密度實驗 取大鼠空白血漿200μl，分別加入二氯二茂鈦標準溶液，制備成10，40，100μg/m l三個濃度，各取6份，按“血漿樣品的處理及測定方法”項下進行分析測定，記錄色譜峰，其色譜峰面積的相對標準偏差RSD為1.8%，符合規定。

3.3 提取回收率實驗 取大鼠空白血漿200μl，分別加入二氯二茂鈦標準溶液，制備成10，40，100μg/m l三個濃度，各取6份，除不加內標外，按“血漿樣品的處理及測定方法”項下進行分析測定，以二氯二茂鈦的峰面積與相應濃度的標準溶液直接進樣的峰面積之比計算回收率。結果表明在上述三種濃度下回收率分別為79.8%，81.4%，78.6%，RSD分別為1.6%，1.8%，1.5%。

4 小結

本文建立的反相高效液相色譜內標法的優點是簡單快速，專屬性強，可同時測定有關物質和制劑中二氯二茂鈦的測定，也可用于血樣中二氯二茂鈦的測定。

［1］ O’Connor K，Gill C，Tacke M，etal．Novel titanocene anti-cancer drugs and their effect on apoptosis and the apoptotic pathway in prostate cancer cells．Apoptosis，2006，11(7):1205-1214.

［2］ Fichtner I，Pampillón C，Sweeney NJ，etal．Anti-tumor activity of Titanocene Y in xenografted Caki-1tumors in mice．Anticancer Drugs，2006，17(3):333-336.

［3］ 李云蘭，李青山，趙大龍，白小紅．二氯二茂鈦原料藥的穩定性研究．山西醫科大學學報，2000，31(5):34．

［4］ 李云蘭，寧美英，李青山．正相高效液相色譜法測定有機金屬抗癌原料藥二氯二茂鈦的含量．色譜，2007，25(2):282．

［5］ 杜建紅，李云蘭，李青山．反相高效液相色譜法測定有機金屬抗癌原料藥二氯二茂鈦的含量．中國現代藥物應用，2009，3(1):28-29．

Determ ination of titanocene dichloride in rat p lasm by reversed-phase high-performance liquid chrom a-

tography

DU Jian-hong，LIYun-lan，LIQing-shan．School of Pharmaceutical Science，Shanxi Medical University，Taiyuan 030031，China

ObjectiveAmethod for the determination of a novelorganometallic antitumor crude drug titanocene dichloride in rat plasm by reversed-phase high-performance liquid chromatography was established．MethodsA Shimadzu VP-ODS column(250mm×4.6mm，5μm)was used．Themobile phasewas consisted of methanol and ammonium acetate(55∶45，v/v)ata flow rate of1.0ml/min．The UV detction wavelength was set at254nm and the column temperaturewas room temperature．Aminopyrinewas selected as an internal standard to determine．Samplesof plasm were separated with liquid-liquid extractionmethod．ResultsThe linear range of titanocene dichloride in rat plasm was10～120μg/ml，and the regression equation was Y=57.83X-0.6042，(r=0.9991，n=7)．The RSD of precision was1.8%(n=6)，and the RSD ofaverage reproducibilitywas0.63%(n=9)．ConclusionThe analyticalmethod was simple，quick，accurate and seletive for the analysis of the content of novel organometallic antitumor crude drug titanocene dichloride in rat plasm．The study provides experimental evidence for detection of concentration of drug in plasm and kinetics study．

Titanocene dichloride;Reversed-phase high-performance liquid chromatography;Plasm;Content determination

030001山西醫科大學藥學院