血液凝固分析儀檢測原理和質(zhì)量控制管理的研究

劉建新 蘇 磊 袁衛(wèi)英 馮璐瓊 王 博 邢家偉

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了單純輔助臨床診斷的認(rèn)識范圍。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，臨床檢驗(yàn)的范圍日益廣泛，檢驗(yàn)的項(xiàng)目越來越多。在血栓或止血實(shí)驗(yàn)室中最基本的設(shè)備就是血液凝固分析儀。利用血凝儀進(jìn)行血栓與止血的實(shí)驗(yàn)室檢查，可為出血性和血栓性疾病的診斷、溶栓和抗凝治療的監(jiān)測及療效觀察提供有價值的指標(biāo)。血栓與止血的檢測已從傳統(tǒng)的手工方法發(fā)展到應(yīng)用全自動血凝儀，從單一的凝固法發(fā)展到免疫法和生物化學(xué)法，血栓與止血的檢測也因此變得簡便、迅速、準(zhǔn)確、可靠。目前，自動血凝分析儀已經(jīng)從第一代單純使用終點(diǎn)法的半自動單通道血凝分析儀、第二代使用多通道和多種測定原理與方法的半自動 血凝分析儀，發(fā)展到第三代全自動血凝儀，可迅速定量分析與凝血、抗凝及纖溶有關(guān)的多種因子。

凝血時間是指血液自血管抽出放入試管中，從液態(tài)的溶膠狀態(tài)變?yōu)榘牍腆w凝膠狀態(tài)所需要的時間。為了避免手術(shù)中出血，在患者手術(shù)前要進(jìn)行血液凝固項(xiàng)目的檢測。由于影響止血的因素很多，因此以往常規(guī)中用出血時間和凝血時間作為診斷指標(biāo)，其結(jié)果異常時再進(jìn)一步做較復(fù)雜的試驗(yàn)尋找病因。此外，凝血時間可作為某些疾病的篩查依據(jù)[1]。

1 血液凝固分析儀的檢測原理

目前開展的血栓或止血成分檢測方法，主要方法有凝固法、底物顯色法、免疫法等。凝固法是血凝分析儀和血栓或止血實(shí)驗(yàn)中最基本、最常用的方法。

2.1 凝固法及其分類[2-3]

凝固法按測量原理可分為電流法、光學(xué)法和磁珠法3類。由于光學(xué)法幾乎可涵蓋各種檢測方法，為了降低儀器制造成本，全自動血凝儀以光學(xué)法居多。凝固法是通過檢測血漿在凝血激活劑作用下的一系列物理量(光、電、機(jī)械運(yùn)動等)的變化，再由數(shù)模轉(zhuǎn)換分析得到最終結(jié)果，所以也可將其稱作生物物理法。

2.1.1 電流法

電流法利用纖維蛋白原無導(dǎo)電性而纖維蛋白具有導(dǎo)電性的特點(diǎn)，將待測樣品作為電路的一部分，根據(jù)凝血過程中電路電流的變化來判斷纖維蛋白的形成。

2.1.2 光學(xué)法

光學(xué)法血凝儀是根據(jù)凝固過程中濁度的變化來測定凝血功能的。根據(jù)儀器不同的光學(xué)測量原理，又可分為散射比濁法和透射比濁法兩類(如圖1所示)。

圖1 散射或透射比濁法原理圖

(1)散射比濁法：散射比濁法是根據(jù)待驗(yàn)樣品在凝固過程中散射光的變化來確定檢測終點(diǎn)的。

(2)透射比濁法：透射比濁法是根據(jù)待測樣品在凝固過程中吸光度的變化來確定凝固終點(diǎn)的。

2.1.3 雙磁路磁珠法

測試杯的兩側(cè)各有一組驅(qū)動線圈，它們產(chǎn)生恒定的交替電磁場，使測試杯內(nèi)特制的去磁小鋼珠保持等幅振蕩運(yùn)動。凝血激活劑加入后，隨著纖維蛋白的產(chǎn)生增多，血漿的粘稠度增加，小鋼珠的運(yùn)動振幅逐漸減弱，儀器根據(jù)另一組測量線圈感應(yīng)到小鋼珠運(yùn)動的變化，將運(yùn)動幅度衰減到50%時確定為凝固終點(diǎn)。

2.2 底物顯色法及其原理[4-7]

底物顯色法是通過測定產(chǎn)色底物的吸光度變化來推測所測物質(zhì)的含量和活性的，該方法又可稱為生物化學(xué)法。

血凝儀使用產(chǎn)色底物檢測血栓與止血指標(biāo)的原理：通過人工合成具有某種特定作用位點(diǎn)的小段肽，將可水解產(chǎn)生物的化學(xué)基團(tuán)與作用位點(diǎn)的氨基酸相連。測定時由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不僅能作用于天然蛋白質(zhì)肽鏈，也能作用于人工合成的肽段底物，從而釋放出產(chǎn)色基團(tuán)，使溶液呈色。產(chǎn)生顏色的深淺與凝血因子活性呈比例關(guān)系，故可進(jìn)行精確的定量。目前人工合成的多肽底物有數(shù)十種，而最常用的是對硝基苯胺(PNA)，呈黃色，可用405 nm波長進(jìn)行測定。底物顯色法特異性及精密度較高，而且易于自動化，為血栓或止血檢測開辟了新途徑。

2.3 免疫學(xué)方法及其原理[5]

在免疫學(xué)方法中以純化的被檢物質(zhì)為抗原，制備相應(yīng)的抗體，然后利用抗原抗體反應(yīng)對被檢物質(zhì)進(jìn)行定性或定量測定。

(1)免疫擴(kuò)散法：將被測物與相應(yīng)抗體在一定的介質(zhì)中結(jié)合，測定其沉淀環(huán)的大小，與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，計算待測物的濃度。此方法適合含量較高的凝血因子的檢測。

(2)“火箭”電泳：在一定電場中，凝膠支持物內(nèi)的被檢物與其相對應(yīng)抗體結(jié)合形成“火箭”峰，“火箭”峰的高度與其含量成正比，通過測定峰高并與標(biāo)準(zhǔn)值比較而進(jìn)行定量測定。此方法操作復(fù)雜，臨床應(yīng)用較少。

(3)雙向免疫電泳：通過水平與垂直兩個方向進(jìn)行電泳可將某些分子結(jié)構(gòu)異常的凝血因子進(jìn)行分離。

(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)：用酶標(biāo)抗原或抗體和被檢物進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過洗滌除去未結(jié)合的抗原或抗體及標(biāo)本中的干擾物質(zhì)，留下固定在管壁的抗原抗體復(fù)合物，然后加入酶的底物和色原性物質(zhì)，經(jīng)過反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，顏色的深淺與被檢物濃度水平成比例關(guān)系。該方法特異性及敏感度較高，目前已用于許多止血、血栓成分的檢測。

(5)免疫比濁法：將被檢物質(zhì)與相應(yīng)的抗體混合形成復(fù)合物，產(chǎn)生足夠大的沉淀顆粒，通過透射比濁或散射比濁進(jìn)行測定。此方法操作簡便，準(zhǔn)確性好，便于自動化。免疫比濁法可分為直接濁度法分析和乳膠比濁法分析。乳膠比濁法分析是將欲待檢物質(zhì)相對應(yīng)的抗體包被在直徑為15～60 nm的乳膠顆粒上，然后與被檢物結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的乳膠顆粒凝集，體積增大，使透射光和散射光的變化更為顯著，從而提高試驗(yàn)的靈敏度。

2.4 幾種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)

用電流法來判斷凝固終點(diǎn)不可靠且單一,所以這種方法很快被更靈敏、更易擴(kuò)展的光學(xué)法所代替。

(1)散射比濁法測定時，當(dāng)測定含有干擾物(高脂血癥、黃疸和溶血)或底纖維蛋白原血癥的特殊樣本時，由于本底濁度的存在，其作為起始點(diǎn)0%的基線會隨之上移或下移，儀器在數(shù)據(jù)處理過程中用本底扣除的方法來減少這類標(biāo)本對測定的影響。以犧牲有效信號的動態(tài)范圍為代價，對于高濁度標(biāo)本并不完全有效。就濁度測量原理而言，散射比濁法更為合理、準(zhǔn)確。這類儀器的光源、樣品、接收器成直角排列，接收器得到完全濁度測量所需的散射光。而在透射比濁法中，光源、樣品、接收器呈一直線排列，接收器得到的則是很強(qiáng)的透射光和較弱的散射光，前者是有效成分，后者應(yīng)扣除，因此要進(jìn)行信號校正，并按經(jīng)驗(yàn)公式換算散射濁度。此法儀器簡單，但精度較差。

(2)光學(xué)法凝血測試的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、儀器結(jié)構(gòu)簡單、易于自動化，缺點(diǎn)是樣品的光學(xué)異常、測試杯的光潔度、加樣中的氣泡等都會成為測量的干擾因素。光學(xué)法血凝儀的最大缺點(diǎn)是遇到有較高初始濁度的樣品就無能為力，為了克服樣品的干擾，不同型號的光學(xué)法血凝儀中采取了各種不同的措施。有的用本底扣除的百分濁度法，這對中、低初始濁度的樣品有補(bǔ)償作用，但不能解決高濁度樣品的測試；有的利用一階微分的峰值作為凝固終點(diǎn)，但微分處理會引起重復(fù)性變差。

(3)雙磁路磁珠法進(jìn)行凝血測試，完全不受溶血、黃疸及高脂血癥的影響，即使加樣中產(chǎn)生氣泡也不會影響測試結(jié)果。磁珠法的試劑用量只為光學(xué)法的一半，因?yàn)樵诒葷釡y量過程中，激發(fā)光束必須照在測試杯的中間，所以要有足夠的試劑量。而在雙磁路磁珠法測量中，鋼珠在測試杯的底部運(yùn)動，因此試劑只要覆蓋鋼珠運(yùn)動即可。雙磁路磁珠法中的測試杯和鋼珠都是專利技術(shù)，有特殊要求。測試杯底部的弧線設(shè)計與磁路相關(guān)，直接影響測試靈敏度。小鋼珠經(jīng)過多道工藝特殊處理，完全去掉磁性。在使用過程中，加珠器應(yīng)遠(yuǎn)離磁場，避免鋼珠磁化。為保證測量的正確性，鋼珠應(yīng)當(dāng)一次性使用。使用磁珠法進(jìn)行測量成本較光學(xué)法大。

此外，磁珠法在測定時具有一定的局限性：①必須有明顯和牢固的凝塊形成才能作出判斷；②弱凝固反應(yīng)對結(jié)果判斷有干擾；③受到外界磁場的影響；④受到血漿黏度的影響；⑤受到很多物理因素的影響；⑥不能開展發(fā)色底物和免疫法檢測。

3 血液凝固分析儀的質(zhì)量控制[8-9]

凝血功能檢測大部分是基于測定纖維蛋白形成時間來判斷終點(diǎn)的，因此干擾因素較多，為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性以及將結(jié)果誤差控制在允許的范圍內(nèi)，就必須建立一套完整的質(zhì)量控制體系。全程的質(zhì)量控制體系應(yīng)包括正確的標(biāo)本采集、適用的實(shí)驗(yàn)方法、穩(wěn)定可靠的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品、日常的設(shè)備維護(hù)等一套程序。

(1)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對標(biāo)本采集的注意事項(xiàng)進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)定。止血、凝血系統(tǒng)由一系列的酶和酶原組成，易被激活或變性，因此標(biāo)本必須按照規(guī)定的方法采集，以保存凝血因子的全部特性。

(2)實(shí)驗(yàn)室需要建立對檢測試劑的評價方法。目前，檢驗(yàn)科使用的多為商品化的檢測試劑，因各廠家試劑的敏感指數(shù)不同，導(dǎo)致結(jié)果也不盡相同，因此選擇檢測試劑因掌握以下原則：①在使用商品試劑時嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進(jìn)行操作，并對試劑進(jìn)行重復(fù)性和敏感性測試；②按照實(shí)驗(yàn)室要求選擇最佳試劑，如有儀器配套試劑應(yīng)優(yōu)先選擇，以保證檢測結(jié)果的溯源性。

(3)實(shí)驗(yàn)室還要建立儀器校準(zhǔn)程序及室內(nèi)質(zhì)控程序。按照儀器廠家產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)對儀器的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)，保證儀器處于正常的工作狀態(tài)，定期使用指定的多水平校準(zhǔn)品對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，并建立相應(yīng)的溯源程序。同時選擇多水平質(zhì)控品，采用滿足要求的質(zhì)控規(guī)則進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，并對室內(nèi)質(zhì)控進(jìn)行周期性評價，保證儀器檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。對使用不同檢測原理的儀器應(yīng)建立相應(yīng)的參考值，并每日核查和記錄溫育的溫度。

(4)實(shí)驗(yàn)室需有檢測方法的評價準(zhǔn)則。同一物質(zhì)使用不同的檢測方法，其結(jié)果也往往不同，因此需對不同的檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證選取最佳檢測方法。

(5)實(shí)驗(yàn)室需參加室間質(zhì)控程序，通過室間質(zhì)控可進(jìn)一步保證每個檢測項(xiàng)目的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)語

血液凝固分析儀是一個復(fù)雜的整體，其各個環(huán)節(jié)都會影響檢測結(jié)果，因此適用的檢測原理及全程的質(zhì)量控制體系將保證測試項(xiàng)目結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

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