鈣網織蛋白重組腺病毒載體構建及體外表達

趙 丹 劉新莉 馬 萍 (中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤研究所，遼寧 沈陽 110001)

鈣網織蛋白重組腺病毒載體構建及體外表達

趙 丹 劉新莉 馬 萍 (中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤研究所，遼寧 沈陽 110001)

目的構建鈣網織蛋白(CRT)基因重組腺病毒載體，并檢測其在293LP細胞中的表達。方法根據Genbank中提供的CRT基因序列，設計并合成引物，以人乳腺癌組織cDNA文庫為模板采用RT-PCR技術擴增人CRT基因片段，測序后將CRT基因片段定向克隆至pShuttle-CMV重組穿梭載體，進而將穿梭載體克隆至PacⅠ限制性內切酶線性化的腺病毒載體pAdxsi。結果重組穿梭載體pShuttle-CRT經EcoRI/KpnⅠ酶切鑒定連接成功。酶切穿梭載體將CRT片段克隆至腺病毒載體pAdxsi得到Ad-CRT，鑒定證實Ad-CRT載體構建成功。Ad-CRT轉染293LP細胞并通過Western印跡法和Real-time PCR法證實其體外表達。結論成功構建CRT重組腺病毒載體Ad-CRT并證實其在293LP細胞中表達。

鈣網織蛋白(CRT);腺病毒載體;基因治療

抗原特異性腫瘤免疫治療和抑制腫瘤血管生成治療的方法能夠區分腫瘤與非腫瘤細胞，進而達到全身系統性治療腫瘤的目的〔1，2〕。鈣網蛋白(CRT)是熱休克蛋白家族成員，為哺乳動物體內高度保守的Ca2+結合蛋白。近期研究表明，由抗原轉運蛋白(TAP)轉運到內質腔內的肽段與CRT相連，成為抗原處理及遞呈過程中熱休克蛋白(HSP)的交接分子，參與誘導MHC-Ⅰ類分子限制的抗原特異性的CTL，產生細胞免疫。既往腫瘤治療研究中，研究人員利用CRT某些基因特性將其用于腫瘤的基因治療，并已取得理想的實驗結果〔3〕。本實驗成功構建了CRT重組腺病毒載體Ad-CRT，并證實其能夠在293LP細胞中有效表達CRT蛋白，為下一步開展腫瘤特異性基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 DH5α化學感受態菌株，真核表達質粒PUC19、pAdxsi腺病毒質粒及pShuttle-CMV(-)重組穿梭載體由本實驗室保存。人乳腺癌組織由中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科提供。Platinum pfx DNA Polymerase試劑盒購自Invitrogen公司;PCR試劑盒購買自大連寶生物公司;限制性內切酶購自New England Biolabs公司;質粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒 (柱離心型)購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司;人胚腎細胞293LP購于中科院上海生物研究所細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 重組穿梭載體pShuttle-CRT的構建及鑒定 將pShuttle-CMV重組穿梭載體用EcoRI/KpnI酶切:酶切體系及反應條件為 pShuttle-CMV 2 μl，10×緩沖液 5μl，10×BSA 5μl，EcoRI 1.5 μl，KpnI1.5 μl，ddH2O 35 μl，37 ℃水浴 3.5 h。CIP 0.5μl去磷酸化，37℃水浴0.5 h。1%的瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收3.4 kb片段。人CRT片段制備:取人乳腺癌組織0.1 g，提取總RNA。使用Platinum pfx DNA polymerase試劑盒進行Touch Down PCR擴增，CRT引物序列為:上游引物:5'-CGGGGTACCACCATGCTGCTATCCGTG-3'，下游引物:5'-CCGGAATTCCTACAGCTCGTCCT-3'。PCR反應條件:94℃5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環; 延伸72℃ 7min，4℃。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，并切膠回收并純化目的基因。行EcoRI，KpnI酶切，CRT30μl，操作同前，回收1.2 kb片段。將處理好的載體片段和CRT片段用T4 DNA連接酶連接，連接體系及反應條件:CRT產物片段 6μl，pShuttle-CMV 2μl，10×ligase緩沖液 1μl，T4 DNA ligase 1μl，22℃ 3.5 h。取3μl連接產物轉化化學感受態細胞DH5α菌株，涂布到卡那抗性固體培養基平皿培養過夜。挑取若干單克隆菌落，接種至卡那抗性液體培養基，于搖床中37℃300 r/min振蕩培養過夜。參照威格拉斯質粒小/中量提取純化試劑盒說明書提取質粒。

1.2.2 構建pAdxsi-CRT病毒質粒 I-CeuI+I-SceI雙酶切處理pAdxsi載體，并做CIP去磷酸化處理酶切反應體系及反應條件:pAdxsi 3.5 μl，10×緩沖液 5 μl，10×BSA 5 μl，I-CeuI(NEB，5 U/μl)2 μl，I-SceI(NEB，5 U/μl)2 μl，ddH2O 36 μl，37℃3.5 h，CIP 0.5 μl去磷酸化，37℃0.5 h。上述酶切反應體系中加入10%SDS 75℃ 滅活10 min。用乙醇沉淀法回收載體:酶切體系加ddH2O 100μl，酚75μl，氯仿75μl，充分混勻，12 000 r/min離心;吸上清至新的離心管中，加入醋酸鈉20μl，再加入無水乙醇500μl，－20℃沉淀15 min;4℃離心，吸去上清，加入70%乙醇500μl，4℃離心，吸去上清，晾干5 min，加入 ddH2O 100μl。I-CeuI+ISceI雙酶切處理插入片段 pShuttle-CRT，pShuttle-CRT 2μl，步驟同前。1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)回收。將處理好的載體片段和插入片段用T4 DNA連接酶連接，步驟同前。將腺病毒載體片段及CRT目的片段連接并提取后以XhoⅠ酶切鑒定，反應條件:Ad-CRT 1 μl，10 × Buffer 1 μl，10 × BSA 1 μl，XhoI(NEB，20 U/μl)0.3 μl，ddH2O 6.7 μl，37℃ 1.5 h。1%瓊脂糖凝膠電泳。陽性克隆:14 kb，11.8 kb，2.66 kb，2.47 kb，2.2 kb，1.45 kb，0.6 kb。

1.2.3 重組腺病毒載體Ad-CRT的擴增、純化及滴度測定

293LP細胞培養于MEM培養基的六孔板 (5×105個細胞/孔)中過夜。線性化重組腺病毒載體 Ad-CRT:Ad-CRT 10μl，10×Buffer 5μl，PacI 20 U，ddH2O 39 μl，37 ℃水浴 3.5 h。取線性化 Ad-CRT 5μl稀釋于 300μl MEM，以 Lipofectamine2000脂質體轉染細胞，6 h換液。每天觀察細胞出毒跡象。轉染后第13天出現明顯噬斑，細胞大部分脫落。收集細胞及上清，反復凍融3次，3 000 r/min離心，收集上清作為第一代毒種。采用TCID50方法測定病毒滴度。

1.2.4 Real-time PCR法檢測CRT基因表達 按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取單純細胞、感染48 h按MOI(感染復數)100∶1的空腺病毒載體細胞和Ad-CRT細胞三組細胞的總RNA。按照試劑盒說明書步驟以各組RNA為模板進行反轉錄，上游引物:5'-GCACTTGGATCCACCCAGAA-3'，下游引物:5'-GAAGTTGTCAAAGATGGTGCCAGA-3'。反應條件為∶37℃15 min，85℃ 5 s。按照試劑盒說明書步驟以cDNA為模板進行Real-time PCR反應，反應條件為∶95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 45 s，共40個循環。

1.2.5 Western印跡法檢測CRT蛋白的表達 RIPA法提取3組 (同1.2.4)細胞蛋白，BCA法定量蛋白，變性后SDSPAGE凝膠電泳 (100 V，1.5 h)，半干法轉膜 (80 V，1.5 h)，羊抗人CRT抗體，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG二抗先后雜交后ECL顯色。

2 結果

2.1 重組穿梭質粒酶切鑒定結果 pShuttle-CRT EcoRI/KpnI酶切鑒定結果見圖1。

2.2 重組腺病毒質粒鑒定結果 pAdxsi-CRT XhoI酶切鑒定結果見圖2。

2.3 Real-time PCR檢測CRT的mRNA表達水平 各組細胞轉染48 h后RNA表達的倍數:293LP組為9.5倍，AD組為22倍，AD-CRT組為240倍。

2.4 Western印跡法檢測CRT基因的蛋白表達水平結果 見圖3。

圖1 pShuttle-CRT鑒定結果

圖2 pAdxsi-CRT鑒定結果

圖3 細胞轉染48 h后CRT蛋白的表達

3 討論

新近研究發現，CRT基因不僅在腫瘤特異性免疫原性方面起作用，而且能夠抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖而對其他細胞系無任何作用。另有研究表明，腫瘤細胞表面CRT的表達，能誘導吞噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，從而介導腫瘤細胞的免疫原性死亡。CRT除能起到分子伴侶和清除凋亡細胞的作用，還能抑制腫瘤血管內皮細胞的增生。CRT包含N-、P-和C-三個結構區域。在CRT的氨基末端，包括180個氨基酸序列是結合調節細胞接觸的整合素α亞單位的區域，是潛在和選擇性內皮細胞生長抑制劑，具有明顯的抑制腫瘤血管生成作用。因此，CRT的導入有望成為腫瘤基因治療的一種有效策略。近年來研究發現紫外線輻射及蒽環類抗生素能夠誘導CRT暴露于腫瘤細胞表面，引發吞噬細胞吞噬功能，進而激發機體的抗腫瘤免疫反應〔4～6〕。已有研究表明，Ad-CRT/HPV16-E7成功構建，并在體內外實驗中表現出明顯的抑制腫瘤血管生成及增強機體產生E7特異性T細胞擴增的抗E7表達的腫瘤的功能〔3〕，然而Ad-CRT載體的構建尚未有報道。因此，本研究選擇這個基因，將靶向免疫性治療及抑制腫瘤血管生成治療二者結合，為進一步的體內外抗腫瘤治療試驗提供了理論基礎。

腺病毒載體具有可感染分裂和非分裂細胞、滴度高、不整合到染色體中，無插入致突變性、能同時表達多個基因等多種優點，被廣泛用于腫瘤的基因治療中〔7〕。我們選擇pAdxsi腺病毒載體系統，通過引入特殊酶切位點，在細胞外完成基因連接，提高了載體構建效率。本結果顯示轉染Ad-CRT的293LP細胞，CRT蛋白及基因表達水平均明顯高于轉染空載體及未轉染的293LP細胞，證實Ad-CRT的成功構建及在體外有效表達，為進一步開展Ad-CRT抗腫瘤的體內外研究實驗提供了實驗基礎。

1 Cheng WF，Hung CF，Chen CA，et al.Characterization of DNA vaccines encoding the domains of calreticulin for their ability to elicit tumor-specific immunity and antiangiogenesis〔J〕.Vaccine，2004;23(29):3864-74.

2 Gomez-Gutierrez JG，Elpek KG，Montes de Oca-Luna R，et al.Vaccination with an adenoviral vector expressing calreticulin-human papillomavirus 16 E7 fusion protein eradicates E7 expressing established tumors in mice〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2007;56(7):997-1007.

3 李丹莉，柳長柏.鈣網蛋白在腫瘤基因治療中的應用〔J〕.廣東醫學，2008;29(5):873-5.

4 Bazan-Peregrino M，Seymour LW，Harris AL.Gene therapy targeting to tumor endothelium〔J〕.Cancer Gene Ther，2007;14(2):117-27.

5 Hsieh CJ，Kim TW，Hung CF，et al.Enhancement of vaccinia vaccine potency by linkage of tumor antigen gene to gene encoding calreticulin〔J〕.Vaccine，2004;22(29-30):3993-4001.

6 Michel Obeid，Antonie Tesniere，Francois Ghiringhelli，et al.Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death〔J〕.Nature Med，2007;13(1):54-61.

7 Wilson DR.Viral-mediated gene transfer for cancer treatment〔J〕.Curr Pharm Biotechnol，2002;3(2):151-64.

R73

A

1005-9202(2012)12-2561-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.053

馬 萍(1960-)，女，教授，博士生導師，主要從事分子腫瘤學研究。

趙 丹(1986-)，女，碩士，主要從事分子腫瘤學研究。

〔2011-05-30收稿 2011-09-20修回〕

(編輯 曹夢園)