自噬基因 Beclin1在人肺腺癌A549細胞系SP及非SP細胞亞群中的表達

趙星趙松楊洋

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

自噬基因 Beclin1在人肺腺癌A549細胞系SP及非SP細胞亞群中的表達

趙星趙松楊洋

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

目的探討自噬基因Beclin1在人肺腺癌A549細胞系SP及非SP細胞亞群中的表達。方法用流式細胞學方法分選人肺腺癌A549細胞系中SP細胞及非SP細胞亞群，采用Western印跡方法檢測Beclin1蛋白在SP細胞及非SP細胞亞群的表達情況。結果流式細胞學方法成功分選得到SP細胞及非SP細胞亞群，Western印跡檢測Beclin1蛋白在SP細胞亞群中的相對表達量為2.795±0.090，在非SP細胞亞群中的相對表達量為3.048±0.124，兩組表達量比較差異有統計學意義(t=5.220，P＜0.05)。結論自噬相關基因Beclin1在人肺腺癌A549細胞系SP細胞亞群中的表達較非SP細胞下降，這可能與SP細胞亞群具有的腫瘤干細胞特性有關。

自噬;Beclin1;側群干細胞;肺癌

目前，普遍認為腫瘤起源于腫瘤干細胞，腫瘤干細胞具有和普通干細胞相似的特性〔1〕，雖然在腫瘤中占極小的比例，卻是腫瘤發生、發展及轉移的根源。對側群干細胞(SP)進行研究以獲取腫瘤干細胞的相關特性是目前的研究熱點與常用方法。自噬性死亡為Ⅱ型程序性死亡，同時作為一種應急機制也與腫瘤的發生發展密切相關，研究發現一些抑瘤作用與自噬及自噬性死亡存在一定的關系〔2〕。Beclin1是編碼自噬相關蛋白的重要基因，已有研究報道該基因在肺癌組織中的表達較正常肺組織下調〔3〕。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人肺腺癌A549細胞系(鄭州大學公共衛生學院實驗室)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。RPMI1640培養基(北京索來寶試劑公司)，Hoechest33342、維拉帕米(Verapamil)、碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)，Beclin1一抗(兔抗人，北京博奧森生物技術有限公司)，β-肌動蛋白(βactin)北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法 細胞培養用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養基，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養;0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的1∶1混合液消化、傳代。實驗采用對數生長期細胞。

1.3 細胞分選 選擇對數生長期細胞，離心棄原培養液后，加入預熱至37℃的含2%胎牛血清的RPMI1640培養基，細胞計數，調節細胞懸液濃度至1×106/ml;準備干燥標準流式上樣管(5 ml規格，聚丙烯材料)，兩管中分別加入上述細胞懸液1 ml，同時加入Hoeehst33342溶液至終濃度為5μg/m l，在對照管加入Verapamil，使終濃度為50μg/ml;充分吹打均勻后封口，置于已預熱至37℃恒溫搖床作用120 min，混勻溶液使細胞充分染色;染色完成后，兩試管中立即加入預備的4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)終止反應;4℃，1 200 r/min離心5 min，小心棄上清，重懸于4℃含2%胎牛血清的PBS溶液中。加入PI至終濃度為1 mg/L，上流式細胞儀檢測、分選細胞。Hoechst33342的激發光為346 nm紫外光，424/44帶通收集藍光，630/22帶通收集紅光。PI的激發光為488 nm藍光，用575/26帶通收集紅光。

1.4 SP和非SP亞群細胞的熒光比較 取分選后的SP和非SP細胞懸液各1μl置于載玻片上，分別在光鏡和熒光顯微鏡下觀察，比較SP和非SP亞群細胞形態差異、熒光強弱。

1.5 Western印跡檢測 用 RIPA buffer 200μl裂解細胞，應用考馬斯亮藍，通過測量吸光度值進行蛋白質定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印和封閉后，加入Beclin1抗體(1∶1 000)，4℃過夜，洗膜后加入堿性磷酸酶標記二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，電化學發光法(ECL)顯影，X光片暗室中曝光、顯影。以β-actin作為內參對照，將膠片進行掃描后以目的蛋白的灰度值與內參的灰度值比值進行統計分析。

1.6 統計學分析 采用SPSS11.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

圖1 流式細胞儀分選SP及非SP細胞亞群

2.1 流式細胞儀分選SP及非SP細胞亞群 見圖1。人肺癌細胞經Hoechst33342及PI染色標記，對照管加入Verapamil后，上流式細胞儀分選得到Hoechest33342陰性/弱陽性細胞亞群(SP細胞亞群)和Hoechest33342陽性細胞亞群(非SP細胞亞群)，前者約占活細胞總數的1.10%;由于Verapamil可以阻斷SP排出Hoechest33342，經Verapamil處理后對照管SP亞群細胞含量下降為0.20%。

2.2 SP和非SP亞群細胞的熒光比較 在熒光顯微鏡下觀察可見SP發出微弱的藍光;光鏡下觀察SP，同一視野下，SP與非SP亞群細胞形態無明顯區別。見圖2。

圖2 熒光鏡及光鏡下觀察SP、非SP細胞

2.3 Western印跡方法檢測Beclin1在SP及非SP亞群細胞中的表達 Beclin1在SP細胞及非SP細胞中的相對表達量分別為2.795±0.090，3.048±0.120，兩組比較差異有統計學意義(t=5.220，P ＜0.05)。

3 討論

近年來，肺癌的發病率和死亡率有明顯增高的趨勢，盡管其早期診斷與治療取得了明顯的進展，但總體治療效果并沒有顯著提高，5年生存率依然很低。主要原因是腫瘤細胞生物學特性十分復雜，惡性程度較高，缺乏有效的根治手段，常規治療治愈率低，轉移率及病死率高，預后差。因此，目前對它的癌變機制研究及從細胞層面進行有效的臨床治療的方法的探索受到國內外學者的高度關注〔4〕。

自噬及其與腫瘤的關系逐步成為腫瘤研究的熱點和新方向。自噬究竟是促進腫瘤的發生〔5〕，還是抑制腫瘤的發展〔6〕，不同的研究有不同的結論，學者尚未有統一的認識。目前已有研究報道自噬相關基因Beclin1在肺癌組織中的表達與癌旁組織和正常肺組織中的表達相比是下調的，認為在肺癌細胞中，自噬作用被抑制，蛋白降解減少〔7〕，降解產物為腫瘤細胞提供營養及能量;同時自噬作用清除了抗腫瘤治療的一部分作用，共同作用從而保護并促進肺癌的發展惡化〔8〕。但自噬作用在肺癌細胞中的SP細胞亞群及非SP細胞亞群中的表達是下調還是上升，尚未見報道。通過本文的研究發現，自噬基因 Beclin1在肺癌SP細胞亞群中的表達與非SP細胞亞群中的表達相比下調。通過Beclin1這一自噬基因的指示效應，可表明SP細胞亞群的自噬作用低于非SP細胞亞群。

SP細胞亞群中富含腫瘤干細胞〔9〕，同樣也有學者提出異議〔10〕。有研究認為雖然手術切除了瘤組織、放化療清除了大量腫瘤細胞，但由于對放化療的抵抗性，少量的腫瘤干細胞仍然存在于機體。其通過一系列復雜的無序的增殖分化過程，又有大量的腫瘤細胞產生，即腫瘤的復發。此觀點可以解釋腫瘤放化療效果不佳、復發、轉移等問題〔11〕。肺腺癌中SP細胞亞群的自噬作用低，可能與腫瘤干細胞的分化增殖能力強等有關〔12〕。臨床上，如果通過某些藥物特定針對SP細胞亞群的自噬作用，達到使SP細胞亞群自噬作用降低甚至消失，再通過手術或放化療作用清除腫瘤細胞以達到治療目的;或者通過上調作用而過度自噬使SP細胞亞群死亡，則人肺癌的治療將發生根本性的變革，甚至完全治愈，同時對其他腫瘤的治療也起到借鑒作用。近來已有研究發現，使用雷帕霉素可使SP亞群細胞的自噬作用上調〔13〕，但該藥物與患者的生存分析仍有待于進一步實驗和研究。本文通過Western印跡檢測自噬基因Beclin1在人肺腺癌細胞中SP及非SP細胞亞群中的表達，對肺癌的認識和治療提出新的設想和展望，但真正應用于臨床治療仍需進一步的研究。

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R734.2

A

1005-9202(2012)12-2559-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.052

趙 松(1962-)，男，碩士生導師，教授，主任醫師，主要從事胸部腫瘤的基礎與臨床研究。

趙 星(1984-)，男，在讀碩士，主要從事胸部腫瘤基礎與臨床研究。

〔2011-10-11收稿 2011-02-16修回〕

(編輯 袁左鳴)