內皮型一氧化氮合酶基因導入對高血壓大鼠細胞凋亡的影響

付 軍 張 婧 黃慧琳 冷吉燕 (吉林大學白求恩第一醫院，吉林 長春 130021)

內皮型一氧化氮合酶基因導入對高血壓大鼠細胞凋亡的影響

付 軍 張 婧 黃慧琳 冷吉燕 (吉林大學白求恩第一醫院，吉林 長春 130021)

目的研究內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因導入對高血壓大鼠心臟、腎臟細胞凋亡的影響。方法將實驗大鼠分為自發性高血壓大鼠(SHR)組、AAV-LacZ組和AAV-eNOS組，每組8只，另設8只正常血壓(WKY)大鼠為WKY組。AAV-eNOS組經尾靜脈注射AAV-eNOS 200μl(含eNOS基因拷貝1×1012)，AAV-LacZ組注射AAV-LacZ 200μl，WKY及 SHR組大鼠分別經尾靜脈給予等量0.1 mol/L PBS。應用原位末端標記(TUNEL)法檢測各組大鼠心、腎組織中的細胞凋亡，免疫組織化學方法檢測eNOS的表達。結果①SHR組大鼠心肌組織及腎臟組織染色陽性信號明顯增多，與WKY組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，AAV-eNOS組凋亡陽性信號明顯低于SHR組，差異顯著(P＜0.05)。②SHR組及AAV-LacZ組大鼠心肌組織eNOS表達低于WKY組，差異具有顯著性(P＜0.05);與SHR組大鼠比較，AAV-eNOS組eNOS表達明顯增加，差異具有顯著性(P＜0.05)。各組大鼠腎臟eNOS蛋白表達未見明顯差異。結論eNOS基因導入可明顯抑制心肌及腎臟組織細胞的凋亡，保護靶器官。

內皮型一氧化氮合酶;高血壓;細胞凋亡

高血壓心臟重塑的機制至今尚未完全闡明，有學者認為主要與心肌細胞機械應力增加和多種神經-體液因素及心血管組織旁分泌/自分泌因子的參與有關〔1〕。最近國外研究表明，高血壓主要靶器官(心、腦、腎)中均存在細胞凋亡現象，推測心肌細胞凋亡可能在高血壓心肌肥厚和心力衰竭發病中起重要作用〔2〕，為從全新的角度認識高血壓、心肌肥厚和心力衰竭的發病機制提供了新的思路。本研究通過導入內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因，觀察其對高血壓大鼠心臟、腎臟細胞凋亡的影響，進一步探討eNOS基因保護靶器官的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 凋亡細胞原粒末端轉移酶標記法(TUNEL)檢測試劑盒，武漢博士德生物工程公司;人腺相關病毒(AAV)-eNOS轉染、鑒定、包裝、擴增、濃縮等過程均由美國佛羅里達大學王秀清教授完成。雄性自發性高血壓大鼠(SHR)及正常血壓(WKY)大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號:SCXK(京)2002-0003。將大鼠置于動物實驗室，室溫控制在17℃ ～21℃，濕度50% ～70%，每日通風2～3次，每次1 h。控制晝夜光照，避免過多噪聲及其他干擾。大鼠分籠飼養(干籠，水沖式)，每籠4只。給予通用鼠料喂養，飲水采用自來水煮沸后的冷卻水，不限制進食量及飲水量。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為SHR組、空載體對照組(AAV-LacZ組)和eNOS治療組(AAV-eNOS組)，每組8只，另設8只WKY大鼠為WKY組。AAV-eNOS組經尾靜脈注射AAV-eNOS 200μl(含 eNOS基因拷貝 1×1012)，AAV-LacZ組注射 AAV-LacZ 200μl，WKY組及 SHR組大鼠分別經尾靜脈給予等量0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2.2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌及腎臟組織細胞凋亡(1)操作步驟:常規制備的心肌、腎臟組織石蠟切片在37℃恒溫箱中烤片過夜，然后常規脫蠟，梯度酒精脫水。用蛋白酶 K(20μg/ml溶于 Tris-HCl中，pH7.4～8.0)室溫孵育 30 min。新鮮配制的3%H2O2溶液室溫避光浸泡30 min，封閉內源性過氧化物酶。PBS振蕩洗滌 2次，每次 5 min，滴加 50μl TUNEL反應混合溶液，陰性對照以不含Bio-dUTP的TDT反應液代替，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS液振蕩洗滌3次。加入50μl轉化劑辣根過氧化物酶(POD)，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS液振蕩洗滌3次，加入50～100μl二氨基聯苯胺(DAB)底物溶液，室溫孵育10 min，PBS液振蕩洗滌3次。蘇木素復染2 min，脫水、透明、封片、鏡檢。(2)結果定量分析:以細胞核內呈現棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。凋亡陽性細胞核呈棕黃色，陰性細胞核呈藍色。在每張切片區隨機選取10個高倍鏡視野(×400)，用 Image-Pro-Plus圖像分析系統進行圖片處理，對所選視野內的陽性信號進行圖像分析，計算各組大鼠心肌、腎臟組織陽性信號的平均光密度。

1.2.3 免疫組化法檢測各組大鼠心肌及腎臟組織中 eNOS、AT1表達 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)二步法進行免疫組織化學染色，以 PBS代替一抗作陰性對照。以細胞質內呈現棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。在每張切片區隨機選取10個高倍鏡視野(×400)，用Image-Pro-Plus圖像分析系統進行圖片處理，對所選視野內的免疫組化陽性信號進行圖像分析，計算各組大鼠心肌、腎臟陽性信號的平均密度。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行分析，實驗數據用±s表示，采用單因素方差分析(ANVOA)，組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 TUNEL檢測結果 SHR組大鼠心肌組織及腎臟組織染色陽性信號明顯增多，與WKY組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，AAV-eNOS治療組凋亡陽性信號明顯低于SHR組，差異顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心臟及腎臟組織TUNEL檢測結果(±s，n=8，%)

表1 各組大鼠心臟及腎臟組織TUNEL檢測結果(±s，n=8，%)

與WKY組比較:1)P＜0.05;與SHR組比較:2)P＜0.05;與AAVLacZ組比較:3)P＜0.05;下表同

18.3±2.2 16.7±1.9 SHR組 44.6±4.11) 54.6±5.41)AAV-LacZ組 43.5±5.11) 53.6±5.91)AAV-eNOS組 27.6±2.91)2)3) 29.8±3.91)2)3)組別 心臟 腎臟WKY組

2.2 eNOS免疫組化檢測結果 WKY組心肌細胞質中可見eNOS陽性表達信號，SHR組及AAV-LacZ組大鼠心肌組織eNOS表達低于WKY組，且差異有顯著性(P＜0.05);AAV-eNOS組eNOS表達明顯增加。各組大鼠腎臟eNOS蛋白表達未見明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心臟及腎臟組織eNOS及AT1免疫組化檢測結果(±s，n=8，%)

表2 各組大鼠心臟及腎臟組織eNOS及AT1免疫組化檢測結果(±s，n=8，%)

組別 心臟eNOS AT1 腎臟23.2±3.4 16.0±2.2 6.1±0.5 13.6±1.1 SHR組 17.6±1.71) 37.6±2.91) 5.6±0.7 27.6±2.71)AAV-LacZ組 17.8±1.61) 36.5±3.21) 5.5±0.7 27.5±2.21)AAV-eNOS組 47.2±4.11)2)3)27.5±3.61)2)3) 6.1±0.9 16.6±1.91)2)3)eNOS AT1 WKY組

3 討論

本研究應用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，發現SHR的心肌細胞凋亡率較WKY大鼠明顯升高，說明心肌細胞凋亡是高血壓靶器官損害的表現之一;用AAV-eNOS靜脈注射4 w后，治療組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低，表明AAV-eNOS可抑制心肌細胞凋亡，從而實現抑制心肌纖維化、保護心肌功能的作用，但其具體機制尚需進一步研究。心肌細胞凋亡在SHR心臟重塑方面起重要作用，心肌細胞凋亡減少可能與左心室高壓(LVH)有關，而心肌細胞凋亡增多可能與慢性心力衰竭(CHF)有關，在SHR高血壓→LVH→心力衰竭演進過程中其心肌細胞增生與凋亡的程度不同，可能存在明顯的心肌細胞增生與凋亡的時間窗。心肌細胞增生為主的時間窗可能為SHR出生后至1個月以內和5～17個月之間，而心肌細胞凋亡為主的時間窗可能為1～4個月之間和18個月以后。SHR早期發生LVH之前出現短暫心肌細胞凋亡增多的機制目前尚不清楚，推測可能與心臟對心肌細胞增生過度的代償性反應(即代償性心肌細胞凋亡增多)有關〔3～5〕。此時的心肌細胞凋亡增多可能是繼發性的心肌細胞凋亡增多。當代償性心肌細胞凋亡無法對抗SHR的心肌細胞增生時，心臟的適應性反應就會發生逆轉而進入心肌細胞增生、肥大和原發性心肌細胞凋亡不足，出現LVH。SHR長期慢性壓力超負荷時心肌細胞凋亡再次被觸發，造成過度代償肥厚的心臟心肌細胞逐漸丟失，最終導致心力衰竭的機制目前仍未完全闡明。

眾所周知，腎臟也是原發性高血壓繼發性損害的一個重要靶器官之一。目前認為，細胞凋亡在高血壓腎臟損害中既有保護作用又有損傷和致病作用。Aizawa等〔6〕研究發現大鼠連續注射血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)7 d后，腎臟組織中細胞凋亡數目明顯增加，且凋亡細胞主要集中在腎小管間質部。Moreau等〔4〕研究新生SHR心臟和腎臟增生和凋亡情況表明，新生SHR與正常血壓大鼠相比，前者心臟和腎臟細胞凋亡明顯減少，而增生指數分析結果顯示，前者心臟和腎臟增生明顯增加。由此得出結論，細胞凋亡減少會導致(至少部分導致)新生SHR心臟和腎臟增生。本研究發現，SHR組大鼠腎臟組織中可見大量細胞凋亡，尤以腎小球系膜細胞為重，但間質也可見廣泛細胞凋亡，說明細胞凋亡也是SHR繼發腎損害的機制之一。應用AAV-eNOS治療4 w后，治療組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低，表明AAV-eNOS治療有保護原發性高血壓腎臟損害的作用，但其具體機制尚不清楚。

1 龍超良，汪 海，肖文彬.高血壓心血管重構及其藥物治療〔J〕.軍事醫學科學院院刊，1997;21(1):63-7.

2 Hamet P，Richard L，Dam TV，et al.Apoptosis in target organs of hypertension〔J〕.Hypertension，1995;26(4):642-8.

3 Li Z，Bing OH，Long X，et al.Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat〔J〕.Am JPhysiol，1997;272(5-2):2313-9.

4 Moreau P，Tea BS，Dam TV，et al.Altered balance between cell replication and apoptosis in hearts and kidneys of newborn SHR〔J〕.Hypertension，1997;30(3-):720-4.

5 Hamet P，Moreau P，Dam TV，et al.The time window of apoptosis:a new component in the therapeutic strategy for cardiovascular remodeling〔J〕.J Hypertens Suppl，1996;14(5):65-70.

6 Aizawa T，Ishizaka N，Kurokawa K，et al.Different effects of angiotensinⅡand catecholamine on renal cell apoptosis and proliferation in rats〔J〕.Kidney Int，2001;59(2):645-53.

R544.1

A

1005-9202(2012)12-2537-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.043

吉林省科學技術廳資助項目(No.200505199)

冷吉燕(1965-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事老年病學研究。

付 軍(1959-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事老年病學研究。

〔2011-12-29收稿 2012-01-20修回〕

(編輯 袁左鳴)