內皮衍生基因-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達

孫亞東 張景斌 王海英 馬 彥 姜春浩 邸 軍 (吉林省人民醫院內分泌科，吉林 長春 130021)

內皮衍生基因-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達

孫亞東 張景斌 王海英 馬 彥 姜春浩 邸 軍 (吉林省人民醫院內分泌科，吉林 長春 130021)

目的探討甲狀腺乳頭狀癌組織中內皮衍生基因-1(EG-1)表達的臨床意義。方法選取吉林省人民醫院2006年2月至2008年9月普外科收治的38例甲狀腺乳頭狀癌患者，另取15例良性甲狀腺疾病病例作為對照組，應用RT-PCR方法檢測EG-1基因水平。結果38例甲狀腺乳頭狀癌組織中有23例檢測出EG-1 mRNA的表達，陽性表達率為61%(23/38);15例甲狀腺瘤組織中有5例檢測出EG-1 mRNA表達，陽性表達率為20%(3/15)，組間比較EG-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織的陽性表達率高于甲狀腺瘤組織(P＜0.05)。EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與組織學分級有關(P＜0.05)，與性別、年齡無關(P＞0.05)。結論EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中異常高表達，可能參與甲狀腺癌的發生和發展。

內皮衍生基因-1;基因表達;甲狀腺癌

調查顯示，我國甲狀腺癌發病率逐年增加〔1〕，目前對其分子發病機制的研究越來越深入，已發現不少基因與甲狀腺癌的發生、發展、轉歸有關〔2，3〕。以往研究發現，內皮衍生基因-1(EG-1)與內皮細胞、上皮細胞的增生激活狀態相關〔4〕，而EG-1在甲狀腺癌組織的表達少有報道。本研究通過RT-PCR方法檢測EG-1在甲狀腺癌組織中的表達，探討其在甲狀腺癌發生和發展中的作用，為判定甲狀腺腫瘤的良惡性和生物行為提供一定指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2006年2月至2008年9月普外科收治的38例甲狀腺乳頭狀癌患者，其中男12例，女26例，年齡30～66〔平均(48±16)〕歲，均經病理科專家確診，所有病例術前均未行放、化療。甲狀腺癌的組織學分級參照選擇性血管造影(SAG)評分標準，SAG評分0分為I級，1分為Ⅱ級，2～3分為Ⅲ級，其中I級9例，Ⅱ級17例，Ⅲ級12例。另取15例良性甲狀腺疾病病例作為對照組。所有病例均獲取其甲狀腺組織石蠟包埋塊。

1.2 方法

1.2.1 石蠟包埋標本RNA提取〔5，6〕取石蠟包埋標本，切片，每片厚度4～5μm，共5～8片，將組織放入1.5 m l離心管，加入1 ml二甲苯常規脫蠟2次，盡可能清除石蠟。用100%乙醇洗滌3次后離心，除去剩余的乙醇，室溫空氣干燥15～20 min。選用Ambion公司試劑盒(Paraffin BlockRNA Isolation kit)提取RNA。依據試劑盒的工作程序將蛋白酶K加入組織已徹底干躁的離心管，45℃水浴110 min后加入600μl RNA提取液孵育5 min，再加入700μl酚-氯仿進行提取，加入1μl線性丙烯酰胺混合后再加入等體積的異丙醇，混勻，－20℃孵育過夜。高速離心，移出上層物，加入75%乙醇洗滌沉淀后移出乙醇，空氣干燥后的沉淀即為所需的RNA。紫外線可見光分光光度計測定RNA含量。

1.2.2 目的RNA擴增 應用上海生工逆轉錄試劑盒(SK2028)轉錄合成cDNA。配成20μl反應體系，RNA模板12μl。選擇β-肌動蛋白(β-actin)做內參照進行擴增，引物序列為:上游 5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3';下游:5'-ATGAGTGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'(上海生工合成);擴增片段366 bp。目的基因EG-1擴增引物序列為:上游5'-TGCATCTCTGGTGAGTCAGG-3';下游:5'-TGCCTCAGCTTTGTCAAGTG-3'(上海生工合成);擴增片段246 bp。

1.2.3 RT-PCR擴增 選用Biometra PCR儀，擴增體系為20μl，其中模板2μl。RT-PCR后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像分析系統成像，分析灰度密度并照相。

1.3 統計學方法 應用SPSS10.0軟件行χ2檢驗。

2 結果

2.1 EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺瘤的表達 RTPCR擴增產物為246 bp特異性條帶，以β-actin做內參照，所有mRNA都可擴增出366 bp的β-actin條帶。見圖1。

圖1 各組織EG-1基因RT-PCR檢測結果

2.2 RT-PCR結果顯示 38例甲狀腺癌組織中有23例檢測出EG-1 mRNA的表達，EG-1 mRNA的陽性表達率為63%(24/38);15例甲狀腺瘤組織中有5例檢測出EG-1 mRNA的表達，EG-1 mRNA的陽性表達率為20%(3/15);二者相比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 甲狀腺乳頭狀癌患者EG-1表達與臨床特點間的關系

38例甲狀腺癌組織中，8例為男性，16例為女性;年齡＜45歲11例，≥45歲13例。男性患者的EG-1陽性表達率(67%)較女性患者的EG-1陽性表達率(67%)高，但差異無統計學意義(P＞0.05);年齡＜45歲患者的EG-1陽性表達率(61%)較年齡≥45歲患者的EG-1陽性表達率(65%)低，但差異也無統計學意義(P＞0.05)。將38例甲狀腺癌組織按組織學分級，其中I級9例，EG-1蛋白表達陽性4例(44%);Ⅱ級17例，EG-1蛋白表達陽性11例(53%);Ⅲ級12例，EG-1蛋白表達陽性9例(75%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

甲狀腺癌是常見的內分泌腫瘤，臨床發現的甲狀腺結節中有5%～10%為甲狀腺癌，甲狀腺良性結節除有壓迫等不適癥狀，可不必手術，而甲狀腺癌則需盡早手術切除。因此，如何早期準確地對甲狀腺結節做出定性診斷，顯得尤為重要。而在臨床研究中發現有些結節的性質難以從細胞學上鑒別，隨著對腫瘤基因的深入研究，對甲狀腺癌的分子發病機制有了進一步的認識〔7〕，有助于早期對甲狀腺癌做出診斷。

甲狀腺癌的演進很大程度上依賴于血液供應和新生血管生成，促進內皮細胞增殖、存活和遷移的基因可能會通過刺激血管生成而引起腫瘤的發生和發展。定位于4號染色體的EG-1基因，在富含血管的組織中高表達，如胎盤、睪丸、肝臟〔8〕，與內皮、上皮細胞的激活狀態有關。在關于EG-1基因在乳腺癌組織中表達的研究結果表明，乳腺癌組織EG-1基因表達陽性率顯著高于良性乳腺組織〔9〕。本研究證實EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達，說明EG-1基因的激活與甲狀腺癌的發生有關，而且EG-1基因的激活與甲狀腺癌的進展有關。有研究利用siRNA干擾技術封閉EG-1基因的表達，結果發現體外細胞系增殖明顯下降，異源腫瘤體積明顯減小〔10〕。目前已有學者通過體外試驗研究證明EG-1基因過表達可激活c-Src蛋白，從而激活MAPK信號通路引起細胞的增殖或分化〔11〕。關于EG-1基因促進甲狀腺癌發生及發展的作用機制還有待于進一步研究。

1 關海霞，單忠艷，米小軼，等.普通食鹽碘化前后甲狀腺癌發病變化的11年病理資料分析〔J〕.中國醫科大學學報，2006;35(3):284-5.

2 朱衛東，王 鑫，張一兵.EZH2和P16基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達的臨床意義〔J〕.河北醫藥，2010;32(18):2484-6.

3 唐 穎，崔全才.甲狀腺癌相關基因研究進展〔J〕.診斷病理學雜志，2010;17(5):386-8.

4 Liu C，Zhang L，Shao ZM，et al.Identification of a novel endothelial-derived gene EG-1〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;290(1):602-12.

5 景紅梅，克曉燕，董 菲，等.石蠟包埋組織提起RNA檢測API2-MALT1融合基因的研究〔J〕.北京醫學，2006;28(3):129-31.

6 Lu M，Zhang L，Maul RS，et al.The novel gene EG-l stimulates cellular proliferation〔J〕.Cancer Res，2005;65(14):6159-66.

7 遲曉云，焦淑賢.甲狀腺癌易感基因的研究進展〔J〕.現代腫瘤醫學，2011;19(1):176-9.

8 Zhang L，Maul RS，Rao J，et al.Expression pattern of the novel gene EG-1 in cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(10):3504-8.

9 叢明華，劉 奇，楊朝花，等.乳腺癌組織中EG-1 mRNA的表達與臨床病理特征及預后的關系〔J〕.中華普通外科雜志，2009;24(2):156-9.

10 Lu M，Sartippour MR，Zhang L，etal.Targeted inhibition of EG-1 blocks breast tumor growth〔J〕.Cancer Biol Ther，2007;6(6):936-41.

11 Lu M，Zhang L，SartippourMR，etal.EG-1 interactswith c-Src and activates its signaling pathway〔J〕.Int JOncol，2006;29:1013-8.

R736

A

1005-9202(2012)12-2476-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.013

吉林省自然科學基金項目(No.201015127)

孫亞東(1964-)，女，博士，主任醫師，主要從事內分泌代謝病基礎及臨床研究。

〔2011-11-20收稿 2012-03-27修回〕

(編輯 袁左鳴)