前列腺癌組織miR-221和miR-222的表達及臨床意義

張 進 (山東省醫學科學院基礎醫學研究所，山東 濟南 250062)

前列腺癌組織miR-221和miR-222的表達及臨床意義

張 進 (山東省醫學科學院基礎醫學研究所，山東 濟南 250062)

目的探討前列腺癌(PCa)組織中miR-221和miR-222的表達及其臨床意義。方法采用莖環RT-PCR的方法檢測8例正常前列腺組織、74例PCa組織及其對應的癌旁組織中miR-221和miR-222的表達情況，并結合臨床病理資料進行統計學分析。結果miR-221和miR-222在PCa組織中的表達顯著高于其對應癌旁組織(P＜0.05)及正常前列腺組織(P＜0.05)，其中miR-221的水平還與癌組織分化程度(P＜0.05)以及遠端轉移情況(P＜0.05)相關。結論miR-221和miR-222在PCa組織中表達量升高，其中miR-221的水平還與癌組織分化程度與轉移相關，可能作為PCa診斷和預后的指標。

前列腺癌;miR-221;miR-222

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系統一種常見的惡性腫瘤，具有潛伏期長、發病率高的特點，且發現時常常已經是晚期〔1〕，目前尚無有效的早期檢測手段〔2〕。真核生物中 miRNA廣泛參與神經系統的發育〔3〕、胰島素分泌和脂肪細胞調控〔4〕、造血和紅系分化〔5〕、細胞凋亡和腫瘤形成〔6〕等生物學過程，也有研究提出將miRNA作為腫瘤分子標記物輔助癌癥的診斷和預后〔7〕。miR-221與miR-222是兩種與腫瘤發生關系非常密切的miRNA，研究發現miR-221和miR-222表達失調與許多腫瘤相關〔8～10〕。本研究旨在通過莖環 RT-PCR的方法檢測PCa樣本中miR-221和miR-222的表達情況，并分析兩者與病人臨床資料的相關性，探討這兩種小分子RNA在PCa發生發展中的作用及臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象 收集某醫院2005年2月至2011年4月經直腸的前列腺穿刺活檢和手術切除后液氮保存標本，均經病理組織學確診為PCa的組織及其癌旁組織，各74例(其中有遠端轉移的24例)，另有8例正常前列腺組織作對照。組織保存方式為液氮凍存30 min后放入－80℃保存。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol(Invitrogen)，鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTPs、SYBR Mastermix(Toyobo)、ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，分光光度儀(EPPENDORF)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 ?。?0℃保存的組織標本在液氮中碾碎至粉狀，加氯仿0.2 ml，劇烈震蕩后室溫靜置 3 min，4℃12 000 r/min離心15min，取上清液約300～500μl移至新的EP管中;加500μl異丙醇，混勻后在碎冰中放置20 min;－20℃12 000 r/min離心120 min，去上清取沉淀，加1 m l 75%乙醇漂洗，4℃ 7 500 r/min離心5 min;吸去乙醇，空甩離心后再次吸盡乙醇，開蓋室溫晾干約5 min;加入焦碳酸乙二酯(DEPC)處理過的水20μl溶解，震蕩混勻。采用德國Eppendorf公司分光光度儀(Biophotometer)檢測 RNA溶液 OD260/OD280吸光值，計算RNA濃度和純度，OD260/OD280＞1.8為合格，可用于后續實驗;取2～5μg總RNA加入6 ×RNA loading buffer，1%瓊脂糖電泳分析，其28 S與18 S條帶亮度約為2∶1。

1.2.2 miRNA表達分析 以U6作為內參，分析miR-221及miR-222表達。RT-PCR所用引物由上海生工合成，具體序列見表1。取1μg總RNA以miR-221和miR-222莖環RT引物進行逆轉錄;逆轉錄的反應條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，75℃15 min，反應結束后－20℃保存。以15μl的反應體系進行實時定量PCR miRNA，反應體系包括 1μl RT產物，1× SYBR GreenⅠ Mastermix，0.5 μmol/L miRNA 特 異 前向引物，0.5μmol/L通用的反向引物;實時定量PCR反應條件為95℃10 min，40 個循環(95℃ 15 s，60℃ 1 min)，每個樣品做 3 個復孔，ABI7500熒光定量PCR儀記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數，即Ct值，以U6為內參，以N=2－△Ct表示目的 miRNA的相對表達量。見表1。

表1 RT及PCR引物序列

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，配對比較使用非參數Wilcoxon符號秩檢驗，PCa組間比較使用Mann Whitney U檢驗;PCa組織中miR-221和miR-222與各臨床病理參數之間的關系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行統計學檢驗。

2 結果

2.1 miR-221和miR-222在PCa組織中的表達 miR-221和miR-222在PCa中的相對表達量中位數分別為501.5和570.1，均高于對應癌旁組織，采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗其差異有顯著性(P＜0.05)，即在PCa組織中miR-221和miR-222的表達量均顯著高于癌旁組織及正常前列腺組織。見圖1。

2.2 miR-221與miR-222表達與臨床病理特征的關系 如表2所示，miR-221與miR-222在PCa組織中表達量一般高于其對應的癌旁組織，取癌組織對應癌旁組織中miR-221表達量上調倍數2倍以上的病例記為陽性(39例)，其余病例記為陰性(35例);同樣的處理方式得到miR-221陽性病例37例，陰性病例37例。比較miR-221的表達與各臨床病理參數之間的關系，發現miR-221的表達和腫瘤的分化程度以及有無轉移相關。在分化程度低的癌組織中miR-221的表達量常高于其對應癌旁組織，而癌組織分化程度越高，其miR-221的表達水平與其對應癌旁組織的差別就越小。另外，在有遠端轉移的PCa病例中miR-221的陽性率顯著高于沒有遠端轉移的病例。

3 討論

miRNA在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，在近年來PCa 的研究中，關于 miRNA 的內容也越來越多〔11，12〕。miR-221與 miR-222 是兩種非常重要的 miRNA，在乳腺癌〔13，14〕、膠質母細胞瘤〔15〕、慢性淋巴細胞性白血病〔16〕、甲狀腺癌〔10〕中均起著重要的作用，其中對于miR-221與miR-222在PCa中的研究近幾年也漸漸展開，但是關于miR-221與miR-222在PCa中具體的臨床應用研究尚無報道。本研究發現miR-221和miR-222在PCa組織中的表達顯著高于其對應癌旁組織及正常前列腺組織，提示miR-221和miR-222可能作為PCa的一個診斷指標;而miR-221的水平與癌組織分化程度以及遠端轉移情況相關，說明miR-221可能在PCa的惡化進展過程中扮演重要角色。結合 miR-221 下游靶基因，如 p27〔8，10，16〕、p57〔8〕以及 Bmf〔9〕等基因的抑癌作用，本文結果推測miR-221隨著PCa惡化進展而表達升高可能導致其下游一系列抑癌基因的沉默，從而對癌癥的進一步惡化起了重要作用，而這種作用在多種癌癥的發生發展過程中都可能普遍存在，正如前期在乳腺癌〔13，14〕、膠質母細胞瘤〔15〕、慢性淋巴細胞性白血病〔16〕、甲狀腺癌〔10〕相關臨床資料和細胞學實驗報道中的那樣。但是由于miR-221下游靶基因非常多，上游也有核轉錄因子-KB(NF-KB)、c-Jun等調控因子控制調節〔17〕，這些基因間直接或間接的相互作用非?？赡苄纬梢粋€復雜的交互調控網絡，影響了在有限實驗數據下對miR-221在PCa發生發展中具體作用機制的解釋?？傊狙芯拷沂境鰉iR-221和miR-222在PCa組織中表達量升高，以及miR-221的水平與癌組織分化程度、轉移情況的相關性，可能為其作為PCa診斷和預后指標提供依據。

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R737

A

1005-9202(2012)12-2472-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.011

張 進(1982-)，女，講師，主要從事免疫學研究。

〔2011-09-25收稿 2011-12-16修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)