血清及卵泡液VEGF水平在預測胚胎早期種植中的價值

彭清妹，周志軍，胡曉玲，黃筱金

(1井岡山大學醫學院，江西吉安343000;2南昌大學第一附屬醫院)

流行病學調查表明，我國育齡期夫婦不孕癥的患病率已達10%～15%，并逐年上升。生殖醫學是一門近20余年才發展起來的新興邊緣學科，它以輔助生殖技術(ART)為重點，應用最廣泛的技術是體外受精—胚胎移植(IVF-ET)，俗稱“試管嬰兒”。20多年來，在許多方面，如促排卵、卵子的采集、受精和胚胎培養等影響胚胎質量方面取得很大的進展，胚胎移植回子宮的成功率可達90%，但是即使形態良好的胚胎移植入子宮腔，IVF-ET的妊娠率仍然很低，為30%～40%;目前胚胎的植入率仍只有10%～15%［1，2］。可見植入失敗已成為影響IVF-ET成功的主要因素。國外研究表明植入過程中一些占主要地位的細胞因子或基因表達低下，影響胚胎和子宮內膜的同步發育，從而導致IVF-ET的失敗。本研究通過探討血清內血管內皮生長因子(VEGF)的表達在胚胎早期種植中的預測價值，及卵泡液內VEGF水平與IVF-ET結局的相關性，為今后進一步的臨床和科研工作做準備。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年3～12月在生殖中心接受IVF-ET的不孕癥患者50例，年齡23～36歲;其中原發不孕25例，繼發不孕25例;不孕年限3～9年。納入標準:①年齡≤38歲;②具有正常的月經周期，周期27～32 d;③3個月內無激素使用史及宮腔操作史;④基礎內分泌正常;⑤周期中至少有1個Ⅰ級或Ⅱ級胚胎可供移植;⑥排除多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、腫瘤等。胚胎分級:根據無核碎片占整個胚胎的比例將胚胎質量分為4級［3］:①Ⅰ級:細胞大小均勻，形狀規則，透明帶完整;胞質均勻清晰，沒有顆粒現象，碎片0～5%;Ⅱ級:細胞大小略不均勻，形狀略不規則，胞質可有顆粒現象，碎片5%～20%;③Ⅲ級:細胞大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規則，胞質可有顆粒現象，碎片21% ～50%;④Ⅳ級:細胞大小嚴重不均勻，胞質可有嚴重顆粒現象，碎片在50%以上。

1.2 分組標準 按妊娠結局將50例不孕患者分為2組，A組:妊娠組，30例，年齡(30.67±2.73)歲，不孕年限(5.00±1.26)年，基礎卵泡數(12.4± 2.7)個;B組:非妊娠組，20例，年齡(32.25±3.86)歲，不孕年限(5.25±2.63)年，基礎卵泡數(12.23 ±2.7)個，兩組一般資料比較無統計學差異(P＞0.05)。

1.3 診斷標準 胚胎移植后4周行超聲檢查見妊娠囊及胎芽、原始心管搏動或刮宮見絨毛者，診斷為臨床妊娠。

1.4 標本采集 于IVF-ET周期中的取卵日、移植日及移植后3、7、14 d分別采靜脈血3 mL，并在取卵日采集卵泡液，標本采集后均立即經離心后分裝－20℃保存待檢測。檢測方法為酶聯免疫吸附法(ELISA)，主要實驗試劑:VEGF定量酶聯檢測試劑盒。

1.5 監測指標 基礎血清性激素、基礎卵泡數、HCG注射日內膜，統計促性腺激素(Gn)用量和使用天數，獲卵數、受精率、卵裂率、優質胚胎率，基礎血清性激素采用化學發光法測定。

1.6 統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，率的比較用χ2檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 兩組Gn用量、天數及HCG日內膜厚度比較在IVF-ET治療周期中使用Gn的量及天數可影響到卵細胞的質量，從而影響到受精、卵裂、胚胎的種植，HCG日內膜的厚度也會影響胚胎的種植，最終影響IVF-ET的結局，而通過對兩組患者的使用Gn的用量、天數及HCG日內膜的厚度比較，兩組無統計學差異(P均＞0.05)。

2.2 獲卵數、受精率、卵裂率、優質胚胎率比較 兩組患者的獲卵數及卵裂率無明顯差異，而受精率、優質胚胎率妊娠組高于非妊娠組(P均＜0.05)。見表1。

表1 兩組患者獲卵數、受精率、卵裂率、優質胚胎率的比較

2.4 取卵日血清及卵泡液內VEGF水平比較 兩組取卵日卵泡液內VEGF水平均明顯高于血清，前者是后者的10.05～13.32倍，妊娠組卵泡液內VEGF水平高于非妊娠組，差異有統計學意義(P＜0.01)，而兩組取卵日血清內VEGF水平無明顯差異。見表2。

表2 兩組取卵日血清及卵泡液內VEGF水平比較(±s)

表2 兩組取卵日血清及卵泡液內VEGF水平比較(±s)

組別 n VEGF(pg/mL)取卵日血清 取卵日卵泡液A組30 41.02±10.28 546.25±74.94 B組 20 46.31±22.91 465.63±56.85 P ＞0.05 ＜0.01

2.3 血清VEGF水平在不同時間的表達水平比較兩組血清VEGF在取卵日、移植日均有不同程度的下降，妊娠組在移植3 d后呈逐漸上升趨勢，而非妊娠組移植3 d后則呈明顯下降趨勢;妊娠組移植后7及14 d血清VEGF水平高于非妊娠組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組血清VEGF水平在不同時間的表達水平比較(pg/mL，±s)

表3 兩組血清VEGF水平在不同時間的表達水平比較(pg/mL，±s)

組別 n 取卵日 移植日 移植后3 d 移植后7 d 移植后14 d A組 30 41.02±10.28 31.03±12.90 49.96±22.09 64.22±25.15 64.65±23.01 B組 20 46.31±22.91 29.22±10.69 53.51±22.74 37.23±14.60 43.11±24.18 P ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

胚胎著床是指胚泡進入子宮腔與子宮內膜黏附并逐漸埋入子宮內膜的過程。調控胚胎著床的機制非常復雜，需要母體與胚胎的協同，并且著床的過程有多種物質的參與。目前現有用來預測胚胎種植成功的細胞因子和分子有數十種，比如細胞因子、生長因子、細胞黏附分子、整合素家族、免疫球蛋白超家族和鈣黏附素家族、胞飲突、白血病抑制因子、同源盒基因、雌孕激素受體等［4］。

3.1 VEGF VEGF是Ferrara和Gospdarowiz等于1989年從牛腦垂體濾泡星狀細胞的體外培養基中純化出來的一種具有兩個亞單位的同源二聚體糖蛋白，屬于血小板衍生生長因子類，目前將同VEGF具有相似功能的因子統稱為VEGF家族，其成員包括: VEGF-A、B、C、D、E、F及胎盤生長因子。VEGF是一組功能強大且能產生多種生物學效應的細胞因子，它能夠特異性作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞增殖及體內新生血管形成并增加血管通特透性。VEGF是一種高效的多功能肽，主要與血管上皮表面的特異性受體結合發揮生物學效應。主要功能有［5，6］:促進有絲分裂和趨化作用，在體外促進內皮細胞生長，在體內誘導血管的發生;增加細胞質的鈣離子濃度;提高微血管的通透性;與酪氨酸激酶受體結合，激活細胞介導氧化系統，介導一氧化氮釋放;改變細胞外基質，以利于血管的生長。由于人類女性生殖系統存在獨特的周期性新血管形成，近年來在女性生殖內分泌領域中VEGF受到相當的重視。它可誘導血管及淋巴管生成，在女性生殖方面貫穿從受精、著床、胎盤形成、胎兒生長、發育及分娩全過程［7］，而且與子宮內膜癌、宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的生成、浸潤、轉移關系密切，還可用于臨床對異位妊娠的早期診斷，并在子宮內膜異位癥、子宮肌瘤的發病機制中起著重要作用。

3.2 VEGF在生殖過程中的作用

3.2.1 VEGF與胚胎發育及著床 VEGF不僅存在于卵泡液中，還與早期胚胎的發育及著床密切相關。Krussel等［8］通過測定植入前胚胎VEGF mRNA的表達發現，受孕者植入前胚胎的培養基VEGF mRNA的表達呈陽性，而未受孕者培養基中未測及，VEGF mRNA在89%的胚胎上有表達，這證實VEGF在人類種植前胚胎的表達對著床過程中血管的形成發揮了作用。VEGF除了促進內膜的增生和分化，還調節早期無血管胚胎的發育，促進胚胎的著床。劉以訓研究發現VEGF在胚胎植入早期，在螺旋動脈內皮細胞、絨毛層細胞、母胎界面基底部位都有特異性的表達，表明VEGF參與了絨毛內胎兒血管的新生和母胎蛻膜組織內血管通透性的調節［9］。VEGF還可以促進一氧化氮和前列環素的生成，而前列環素是胚胎著床和子宮內膜蛻膜化的主要啟動因子［10］，在著床期前后促進血管的發生，使子宮內膜血管通透性增加，對胚胎的成功著床至關重要。Lee等［11］發現在胚胎移植后11～14 d妊娠者的血VEGF水平高于非妊娠者，胚胎移植后15～17 d妊娠者血VEGF迅速下降，提示VEGF主要對胚胎著床的早期階段產生影響。當VEGF不足時，不利于胚胎的早期發育與著床，其機理可能與子宮內膜的容受性下降、黃體功能低下、早期絨毛血管形成不良等有關，即使著床也較易發生早期流產。而且VEGF直接影響胚胎的質量，Van Blerkon等［12］研究發現來源于低含氧量卵泡的卵子，不但受精率低，胚胎移植后妊娠率也較低。

3.2.2 VEGF對受精率及妊娠率的影響 在實驗室條件穩定和精子質量正常的情況下，卵母細胞的質量則成為影響受精率的主要因素。卵丘的狀態、透明帶的形態及厚度和卵母細胞與顆粒細胞連接的緊密程度均可以影響精子穿透卵母細胞，從而影響著受精率。聞姬等［13］研究發現卵泡液的VEGF水平在一定范圍內(510～759 ng/L)受精率、卵裂率及妊娠率最高;Barritt等［14］推測當卵泡液內VEGF水平較低時，新生血管生成減少，血管通透性下降，使卵細胞內線粒體DNA缺失增加，功能完善的線粒體減少，卵細胞內ATP的含量下降，從而影響著卵細胞的質量，受精的能力則隨之下降;Filicori等［15］認為卵泡液VEGF水平較低時，血漿蛋白外滲減少，使卵泡液減少，從而不能為卵細胞的生長發育提供Gn、類固醇激素及各種生長因子，由于卵細胞從血液循環中獲得的外源性激素下降導致透明帶增厚，從而影響精子的穿透，影響受精率。而卵泡液內VEGF水平過高時，同樣影響受精率及妊娠率，可能與卵細胞內低糖、缺氧使卵細胞發育不良和退化有關。因此卵泡液內VEGF過高或過低均會影響卵細胞的受精率，最終影響妊娠率。

3.3 妊娠組與非妊娠組中VEGF的表達 Pellicer等［16］、Chad等［17］證實隨著年齡的增長卵泡微循環減少，局部缺氧，使VEGF水平隨著年齡的增長而增加，故在本研究中，納入研究的患者年齡均≤38歲;具有正常的月經周期，周期在27～32 d;3個月內無激素使用史及宮腔操作史;基礎內分泌正常;IVFET或ICSI-ET周期中至少有1個Ⅰ級或Ⅱ級胚胎可供移植;而且排除了多囊卵巢綜合癥、子宮內膜異位癥等疾病。兩組患者的年齡、不孕年限、基礎卵泡數及基礎性激素經統計學分析均無統計學意義，而在IVF-ET周期中Gn的使用天數及使用總量將影響到卵子的質量，從而影響卵子的受精、卵裂，最終影響妊娠結局，而Gn日內膜的厚度會直接影響胚胎的種植，而經統計學分析，兩組上述因素均無統計學差異。因此在排除外在影響因素的條件下，通過檢測IVF-ET后不同時期血清中VEGF水平的變化來預測胚胎的早期種植，而通過檢測取卵日卵泡液中VEGF的水平來推測其與妊娠結局的關系。

IVF-ET周期后根據妊娠結局將兩組分為妊娠組和非妊娠組，兩組患者的獲卵數及卵裂率經過統計學分析，無顯著性差異，取卵日兩組患者血清VEGF水平無明顯差異，而妊娠組取卵日卵泡液內VEGF的水平明顯高于非妊娠組，差異有統計學意義，且妊娠組受精率與優胚率高于非妊娠組，差異有統計學意義。故卵泡液內VEGF水平影響卵子的成熟度、卵子質量、卵泡液內VEGF水平高、卵子成熟度高、卵子質量好、受精率及優質胚胎率高、卵泡液內VEGF水平低、卵子成熟率低、卵子質量差、受精率與優質胚胎率低，這與Van Blerkon等［12］及王克華等［18］的研究結果是一致的，并與聞姬等發現卵泡液內VEGF水平過高過低均會影響卵母細胞質量、受精率及優質胚胎率，且卵泡液內VEGF水平本在510～760 ng/L妊娠結局最好的結果是相一致的。研究通過動態監測IVF-ET后兩組患者不同時間血清內VEGF水平表達情況發現兩組取卵日至移植日血清VEGF水平有不同程度的下降，移植日至移植后3 d則均有不同程度的上升，但兩組之間無明顯差異，妊娠組移植3 d后血清VEGF水平逐漸上升，而非妊娠組于移植3 d后有明顯的下降，兩組之間的差異有統計學意義，Lee等［11］發現IVF-ET后11～14 d，妊娠婦女血清中VEGF高于非妊娠者，而在ET后15～17 d血清VEGF水平急劇下降，提示VEGF對胚胎著床的早期產生影響，而本研究發現在ET后7 d兩組血清VEGF水平即出現明顯的差異，故在移植后動態監測血清VEGF水平的變化能更早地預測胚胎的種植，從而更早地預測IVF-ET的妊娠結局。Lee等［19］證實HCG能促進黃體顆粒細胞產生VEGF，故在IVF-ET周期中如果給予部分患者HCG支持，能使黃體顆粒細胞產生VEGF增加，使卵泡液內VEGF水平提高，促進卵母細胞的成熟，提高卵子的質量、受精率、優胚率，并且血清內VEGF水平也相應增加，有利于胚胎的種植，從而改善IVF-ET周期的妊娠結局，提高IVF-ET周期的妊娠率。

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