小白菊內(nèi)酯對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP增殖及藥物敏感性的影響

李 華，張振銘，朱志圖

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000;2遼河油田第二職工醫(yī)院)

胃癌術(shù)后對(duì)射線治療不敏感，化療成為綜合治療的主要措施，但胃癌多藥耐藥(MDR)的存在常導(dǎo)致化療有效率降低，使其5年生存率＜20%。如能對(duì)胃癌的MDR進(jìn)行干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)，對(duì)提高化療療效、延長患者生存期有重大意義。小白菊內(nèi)酯(PN)是從傳統(tǒng)藥用植物小白菊中提取的有效成分。研究證實(shí)［1～3］，其在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，還發(fā)現(xiàn)其能增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性［4］，但在此領(lǐng)域的研究尚不深入。2011年12月～2012年8月，我們以胃癌耐藥細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討NP對(duì)其增殖及藥物敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 PN(美國Sigma公司)，順鉑(DDP，山東德州制藥廠)，RPMI 1640(美國 Sigma公司)，SGC-7901/DDP胃癌耐藥細(xì)胞株(南京凱基生物技術(shù)有限公司)，MTT(Solarbio公司，NF-κB p65轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)試劑盒(美國Chemicon公司)，NF-κB p65的引物(上游引物5'-GGGAAGGAACGCTGTCAGAG-3'，下游引物5'-TAGCCTCAGGGTACTCCATCA-3'，目的片段369 bp)和內(nèi)參照β-actin的引物(上游引物5'-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3'，下游引物5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3'，目的片段239 bp)、第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌耐藥細(xì)胞 SGC-7901/ ADM接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在含5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

1.2.2 PN對(duì)細(xì)胞增殖的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ mL，接種于96孔板中，每孔200 μL。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，用含不同濃度PN(0、5、10、20、40 μmol/L)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，其中0 μmol/L PN為對(duì)照組。分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)PN對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用，按試劑盒說明操作。細(xì)胞增殖抑制率=(1－處理組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.2.3 PN與DDP協(xié)同性觀察 從1.2.1中得知，20 μmol/L的PN作用胃癌細(xì)胞24 h時(shí)，可明顯抑制細(xì)胞增殖。再以20 μmol/L PN、5 μg/L DDP、10 μg/ L DDP、20 μmol/L PN+5 μg/L DDP、20 μmol/L PN +10 μg/L DDP作用于對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞24 h，以培養(yǎng)基為對(duì)照組，以MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率。根據(jù)公式進(jìn)行協(xié)同性判定，q=E(AB)/(EA+EBEA×EB)。EAB為聯(lián)合處理的抑制率，EA、EB單用A、B藥處理的抑制率，q＜0.85兩藥拮抗，在0.85～1.15為作用單純相加，＞1.15有協(xié)同作用。

1.2.4 細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA的檢測(cè) 采用RT-PCR法。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，分別以培養(yǎng)基、10 μg/L DDP、20 μmol/L PN、20 μmol/L PN+10 μg/L DDP處理24 h，提取各組細(xì)胞總RNA;各取1 μg總RNA，一步法擴(kuò)增成cDNA;取2 μL cDNA以NF-κB p65的上下游引物和內(nèi)參照β-actin的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL。循環(huán)參數(shù):94℃ 5 min，94℃30 s。58℃ 1 min，72℃ 45 s，共25個(gè)循環(huán);再72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察、照相，并用HPlSA 1000圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，用NF-κB與β-actin條帶的灰度比值表示NF-κB的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的檢測(cè) 用Western blot法。接種與處理同1.2.4，收集細(xì)胞提取總蛋白，每孔上樣60 μg蛋白;總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔60 μg蛋白)后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，于室溫條件下封閉1.5 h;再分別用一抗雜交，4℃過夜，洗膜3次，每次10 min;再與稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗膜3次，每次10 min。采用HPlsA 1000圖文分析系統(tǒng)分析膠片，進(jìn)行半定量分析(計(jì)算各條帶的積分光密度值，以NF-κB p65蛋白條帶的積分光密度值與對(duì)應(yīng)內(nèi)參照β-actin的積分光密度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件。所得數(shù)據(jù)用±s表示，用t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 隨著作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加，PN對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)(P均＜0.05)，其中以20 μmol/L PN作用24 h時(shí)的抑制效應(yīng)較明顯。見表1。

表1 不同濃度PN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率的影響(%，±s)

表1 不同濃度PN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率的影響(%，±s)

24 h 48 h 72 h 5μ PN 細(xì)胞增殖抑制率mol/L 4.20±0.73 10.02±0.05 18.35±0.41 10 μmol/L 11.63±0.21 18.73±0.34 30.53±0.74 20 μmol/L 32.50±0.27 58.29±0.53 78.21±0.54 40 μmol/L 74.00±0.38 91.53±0.29 97.05±0.61

2.2 PN與DDP的協(xié)同性觀察結(jié)果 20 μmol/LPN處理24 h后胃癌細(xì)胞增殖抑制率為32.50% ± 0.27%，5、10 μg/L DDP處理后分別為20.93% ± 0.15%、40.27%±1.04%20 μmol/L PN聯(lián)合5、10 μg/L DDP處理后分別為 53.03% ±0.67%、77.96%±0.26%。根據(jù)公式判定 PN聯(lián)合5、10 μg/L DDP的協(xié)同性，q分別為1.19、1.17，均 ＞1.15，表示而二者具有協(xié)同性。

2.3 胃癌細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA及其蛋白檢測(cè)結(jié)果 培養(yǎng)基、10 μg/L DDP、20 μmol/L PN、20 μmol/L PN+10 μg/L DDP處理24 h，胃癌細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA分別為0.437±0.270、0.406± 0.253、0.371±0.394、0.301±0.316，NF-κB p65蛋白分別為0.695±0.115、0.672±0.067、0.452± 0.290、0.361±0.104，20 μmol/L PN+10 μg/L DDP與其他三者比較，P均＜0.05。

3 討論

MDR的存在是困擾腫瘤治療的一個(gè)難題，也是影響腫瘤治療療效、甚至導(dǎo)致化療失敗的重要因素。目前使用的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)化劑在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時(shí)所需的劑量過大，不良反應(yīng)明顯，因而限制了它們的臨床應(yīng)用。

目前，腫瘤MDR的研究約有30余年的歷史，其中明確的途徑如下:①M(fèi)DR-1/P-gp的過度表達(dá);②多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)的過度表達(dá);③肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)對(duì)藥物的胞吐作用;④細(xì)胞解毒系統(tǒng)和DNA損傷修復(fù)作用增強(qiáng);⑤藥物靶點(diǎn)在質(zhì)和量上的改變，減弱藥物的細(xì)胞毒性作用;⑥凋亡抑制基因(如Survivin、Bcl-2)表達(dá)提高及促凋亡基因(如Bax、Fas)表達(dá)的降低;⑦細(xì)胞外環(huán)境(pH、溫度、氧濃度)的改變等;⑧其他與MDR相關(guān)的因子，如COX-2抑制劑物也產(chǎn)生交叉耐藥。目前研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的這種MDR是由多種因素綜合作用造成的。

PN是從傳統(tǒng)中藥中提取的有效生物活性成分，不僅具有抗炎、抑菌、解痙作用，而且不良反應(yīng)小。目前已經(jīng)證實(shí)，PN在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)多種腫瘤增殖具有抑制作用，如乳腺癌、白血病、胃癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤等;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PN的抗腫瘤作用主要是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性和誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)的。NF-κB的激活參與了細(xì)胞生長調(diào)控、腫瘤的形成及MDR的形成，使其成為腫瘤治療的潛在新靶點(diǎn)［5，6］。研究還發(fā)現(xiàn)，PN能增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性，如Riggins等［7］研究發(fā)現(xiàn)PN能增強(qiáng)乳腺癌抗雌激素耐藥細(xì)胞株MCF-7對(duì)他莫昔芬、氟維司群的敏感性，其抗他莫昔芬機(jī)制與NF-κB調(diào)控AKT通路有關(guān)。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，PN能通過抑制NF-κB的DNA聚集增強(qiáng)維甲酸對(duì)白血病HL-60細(xì)胞療效。本實(shí)驗(yàn)中，PN能明顯抑制胃癌耐藥細(xì)胞株的增殖，抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性;PN與DDP聯(lián)合組與單藥組相比抑制作用更顯著，經(jīng)檢驗(yàn)兩者具有協(xié)同作用。通過RT-PCR檢測(cè)證實(shí)PN可明顯下調(diào)胃癌細(xì)胞的NF-κB p65 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PN+ DDP聯(lián)合用藥者組的NF-κB p65蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯減少，明顯少于PN、DDP單藥組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了小白菊內(nèi)酯是NF-κB的抑制劑，能抑制胃癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá);并且PN與DDP有協(xié)同抗腫瘤作用，PN能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株對(duì)DDP的敏感性，從而明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，該作用可能與NP降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)有關(guān)。然而，小白菊內(nèi)酯增強(qiáng)胃癌耐藥細(xì)胞株對(duì)藥物敏感性的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入的研究。

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