nm23和MMP-9表達與結腸癌淋巴結轉移比率相關性研究

徐 健，項洪剛，易 偉，查思洛

(第二軍醫大學附屬長征醫院，上海200003)

反映區域淋巴結侵犯情況的淋巴結轉移比率(LNR)是影響大腸癌預后的ⅠA類決定因子［1］，也是判斷是否行術后輔助治療的主要依據。大腸癌淋巴結轉移和擴散是一個涉及多因素、多階段的復雜過程，已有的研究表明基質金屬蛋白酶-9［2］(MMP-9)和nm23［3］分別可能具有對腫瘤轉移、淋巴結受侵的促進或保護作用。本研究以人結腸癌組織為對象，通過免疫組化染色觀察分析nm23和MMP-9的表達，綜合分析二者與LNR的關系，以期能更好的評判LNR的風險度。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2007年1月～2011年12月第二軍醫大學附屬長征醫院結直腸外科收治并經病理診斷的結腸癌患者567例。患者均為首次接受手術治療，入選病例至少有1枚淋巴結轉移陽性，且送檢淋巴結數達12枚以上，剔除術前放化療病例。其中男366例、女201例，年齡23～92歲、中位年齡62歲。腫瘤分級按WHO分級標準:Ⅰ級(高分化)238例，Ⅱ級(中分化)256例，Ⅲ級(低分化或未分化)73例。送檢淋巴結12～48(14.49±8.68)枚。收集患者性別、年齡及其病理資料等。

1.2 組織芯片免疫組化染色

1.2.1 組織芯片的制備 委托上海芯超生物科技有限公司使用組織陣列儀(美國Beecher公司)制作結腸癌組織芯片，操作流程按收集標本、取材、脫水、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色標記和芯片制作處理。

1.2.2 免疫組織化學染色采用二步法 鼠抗人單克隆抗體 nm23(No:MAB-0139)和 MMP-9(No: MAB-0245)及二步法免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術開發有限公司。每次實驗均以已知的陽性組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。

1.2.3 陽性結果判斷 用Mattern積分法［4］染色指數來評定陽性細胞百分率:每例隨機觀察5個高倍鏡視野(×400):無陽性表達細胞為0分;＜50% 為1分;50% ～75%為2分;＞75%為3分。染色強度:0為不著色;1為淺黃色;2為深黃色;3為棕黃色。染色指數為陽性細胞百分率和染色強度之和。陽性表達指數＞3定為免疫組化染色陽性;≤3定為陰性。

1.3 LNR 將LNR(陽性淋巴結數/全部被檢淋巴結數 ×100%)分為:LNR0(0)，LNR1(＜10%)，LNR2(10%～25%)，LNR3(＞25%)。

1.4 統計學方法 用SPSS16.0統計軟件包進行分析，計數資料組間采用χ2檢驗，多個變量相關性采用Spearman＇s等級相關分析，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 結腸癌nm23和MMP-9的表達及其與臨床病理特征的關系 結腸癌nm23和MMP-9陽性表達產物呈棕黃色，主要定位于細胞質，呈彌漫分布，見插頁Ⅰ圖7、8，陽性表達率分別為51.9%和55.0%。兩者表達差異與患者的性別、年齡無關(P＞0.05)。但低分化、浸潤至漿膜層/淋巴結轉移率高和有遠處轉移的患者，nm23表達陽性率明顯較低，而MMP-9表達陽性率則較高。結果表明nm23和MMP-9的表達與腫瘤分級程度、腸壁浸潤深度、淋巴結轉移率及有無遠處轉移有關，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 nm23和 MMP-9的表達與 LNR的關系

Spearman相關分析顯示，LNR和腫瘤原發灶nm23表達呈負相關(r=－0.561，P＜0.05)，LNR與MMP-9表達呈正相關(r=0.569，P＜0.05)。并且nm23和MMP-9的表達呈負相關(r=－0.434，P＜0.05)。

表1 nm23、MMP-9表達和結腸癌臨床病理特征的關系

3 討論

結腸癌術后病理的LNR是判斷患者預后的重要獨立預后因子，也是確定術后輔助治療的主要依據［5］。美國癌癥聯合會和美國病理學家協會建議至少需檢出12枚淋巴結以上才能較為準確判斷結腸癌的LNR。Wang等［6］的研究發現，LNR是獨立的生存影響因子，優于淋巴結陽性數預測預后，更是Ⅲ期結腸癌準確的預后監測指標。但是由于目前病理手段的局限性和存在病理醫師個人經驗的差異性，我們尚不能做到對所有患者LNR的精確判斷，尤其是對于常規HE染色難以發現的淋巴結內單個轉移腫瘤細胞或轉移腫瘤細胞團直徑≤2 mm的微小轉移。這就很可能導致對LNR的誤判，以至于影響腫瘤分期和后續輔助治療的決策，因此如何采用其他手段聯合病理結果來取得較為精確的LNR，是擺在外科和腫瘤科臨床醫師面前的一個較為重要的課題。

目前針對nm23基因［7］的研究比較廣泛。它包括nm23-H1和nm23-H2。以往的研究表明，它編碼的產物對癌細胞運動能力和轉移潛能有抑制作用［8］，結腸癌和惡性黑色素瘤等的轉移與nm23蛋白表達低下有關，其中的機理可能是通過nm23蛋白產物二磷酸核苷激酶(NDPK)，參與體內高能磷酸鍵轉移，促進細胞分裂，參與G蛋白介導的信號傳遞，影響細胞內微管的聚合和解聚來影響腫瘤細胞的活性。本研究顯示，低分化、浸潤至漿膜層、LNR高和有遠處轉移的患者nm23表達陽性率明顯較低，而且nm23的陽性表達率和LNR存在顯著的負相關，表明nm23對大腸癌淋巴結轉移有明顯抑制作用。

MMP-9是MMPs家族中的重要成員，其分子量最大，是Ⅳ型膠原酶，能夠降解、破壞細胞外基質中最主要的成分Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原和明膠。大量研究表明，腫瘤轉移浸潤的潛能與腫瘤細胞產生MMP-9的能力有著密切的正相關關系，對腫瘤的黏附和能動性有影響。在胃癌、結腸癌等惡性腫瘤中均有MMP-9的顯著增高。這與本實驗研究的結果相一致，低分化、浸潤至漿膜層、LNR高和有遠處轉移的患者中MMP-9表達陽性率明顯高于對照組。同樣LNR與腫瘤原發灶MMP-9表達呈顯著正相關，而且nm23和MMP-9的表達呈負相關。

總之，通過本研究，我們推測大腸癌nm23表達缺失和MMP-9過高表達在淋巴結轉移的早期階段就已發揮作用。因此對于 LNR0的大腸癌患者(Dukes A、B)原發灶中nm23和MMP-9聯合檢測有望成為評估LNR風險度的有用指標，并對臨床制定治療術后輔助措施和判斷預后有重要指導意義。

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［3］Myeroff LL，Markowitz SD.Increased nm23-H1 and nm23-H2 messenger RNA expression and absence of mutations in colon carcinomas of low and high metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst，1993，85(2):147-152.

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［5］Rosenberg R，Engel J，Bruns C，et al.The prognostic value of lymph node ratio in a population-based collective of colorectal cancer patients［J］.Ann Surg，2010，251(6):1070-1078.

［6］Wang J，Hassett JM，Dayton MT，et al.Lymph node ratio:role in the staging of node-positive colon cancer［J］.Ann Surg Oncol，2008，15(6):1600-1608.

［7］Suzuki E，Ota T，Tsukuda K，et al.nm23-H1 reduces in vitro cell migration and the liver metastatic potential of colon cancer cells by regulating myosin light chain phosphorylation［J］.Int J Cancer，2004，108(2):207-211.

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