連翹酯苷對擬AD動物模型學習記憶的改善作用

李長祿，王紅梅，王立為

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193)

隨著人們生活水平的提高，人均壽命隨之增加，全球人口趨于老齡化，阿爾茨海默病(AD)的發病率逐年上升，已成為威脅人們晚年健康的一大隱患。迄今為止，AD患者依然缺乏有效的治療藥物，目前的藥物大部分只對AD的某一環節有阻斷作用，并不能阻斷AD發病的病程，所以這些藥物能夠改善AD早、中期的癥狀，但對AD晚期療效較差。因此，尋找能夠阻斷AD病程發展的多靶點藥物具有更重要的意義。天然藥物作用靶點多且毒性低，所以中藥或中藥提取物已經成為當前研究AD治療藥物的熱點。AD的發病機制復雜，主要有如下幾種假說:膽堿能假說、氧化應激假說、炎癥免疫假說、淀粉樣蛋白假說、基因突變假說等。目前藥物的研究主要集中在氧自由基、炎癥因子及中樞神經元凋亡三個方面。連翹為木犀科植物的干燥果實，具有清熱解毒、消腫散結之功效。連翹酯苷為其主要活性成分，具有抗菌、抗炎及體外抗氧化等藥理作用。我們于2011年7～9月進行本實驗，旨在通過檢測動物行為學變化及生化指標的改變，來評價連翹酯苷用于治療AD的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12月齡SPF級昆明(KM)雄性小鼠60只，2月齡SPF級KM雄性小鼠10只，由中國醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK (京)2009-0007。藥用植物研究所SPF動物房中飼養，實驗室溫度22～25℃，明暗周期12 h/12 h。

1.2 藥物與試劑 連翹酯苷:由中國醫學科學院藥用植物研究所化學室制備;安理申:衛材(中國)藥業有限公司制造，批號090807A;人參皂苷Rg1:上海融禾醫藥科技有限公司，批號100329;β-淀粉樣蛋白(25-35)(Aβ25-35):Sigma產品，批號108K4794;乙酰膽堿酯酶(AchE)、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、單胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 小鼠自主活動儀及Morris水迷宮實時在線檢測分析處理系統由中國醫學科學院藥用植物研究所、中國航天員科研訓練中心、北京三維拓盟數字影像技術有限公司聯合研制開發。

1.4 方法

1.4.1 Aβ25-35的配制與老化 將1 mg Aβ25-35用生理鹽水配制成2 mg/mL的母液，置37℃ CO2恒溫箱孵育4 d，使其變為聚集態的Aβ25-35［1］。

1.4.2 動物分組與給藥 10只2月齡小鼠為青年對照組，60只12月齡小鼠隨機分為6組，即老年對照組、模型組、連翹酯苷低劑量組(50 mg/kg)、連翹酯苷高劑量組(200 mg/kg)、安理申組(3 mg/kg)及人參皂苷Rg1組(10 mg/kg)，以上各組按相應劑量的藥物灌胃，青年對照組、老年對照組和模型組小鼠以相同方法灌胃蒸餾水，1次/d，連續5周。

1.4.3 AD動物模型的建立［2］灌胃第21天時，除青年對照組和老年對照組外各組小鼠分別于腹腔注射0.8%戊巴比妥鈉0.1 mL/10 g，待其麻醉后，右側側腦室(前囟后2 mm，旁開1.5 mm，深度2.5 mm)注射Aβ25-356 μg。

1.4.4 自主活動 自主活動計算機實時在線檢測分析處理系統主要用于觀察藥物對小鼠是否有興奮或抑制等影響。側腦室注射10 d后將小鼠放入自主活動測試箱，適應5 min，測試10 min，計算機自動記錄動物的運動總路程、運動總時間、平均運動速度。

1.4.5 Morris水迷宮實驗［3］灌胃給藥32 d后進行水迷宮實驗，連續6 d。定位航行實驗:灌胃給藥1 h后將動物面向池壁置于水池內進行實驗，歷時5 d，1次/d，每次120 s，記錄動物逃避潛伏期和游出率?？臻g探索實驗:定位航行實驗后將平臺撤去，從目標象限的對角象限將動物面向池壁置于池內，使動物在池內游泳120 s，記錄動物穿臺次數。

1.4.6 腦組織生化指標檢測 待水迷宮測試結束后將小鼠處死，迅速分離海馬和皮層，液氮速凍。檢測時將皮層超聲勻漿制成10%的腦組織勻漿液，4℃以3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說明測定SOD、AchE、ChAT、MAO活力以及MDA含量。

1.4.7 統計學方法 使用SPSS13.0統計軟件進行分析，實驗結果以±s表示，進行多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間差異采用LSD(方差齊)或者Games-Howell法(方差不齊)，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自主活動測試結果 見表1。

表1 連翹酯苷對Aβ25-35導致的學習記憶障礙小鼠自主活動的影響(±s，n=10)

表1 連翹酯苷對Aβ25-35導致的學習記憶障礙小鼠自主活動的影響(±s，n=10)

組別 平均速度(cm/s)運動總時間(s)靜息總時間(s) 1.86±0.22 139.72±12.85 760.13±12.85老年對照組 2.09±0.30 156.22±19.46 743.65±19.74模型組 1.72±0.36 134.64±24.69 765.22±24.68安理申組 1.25±0.22 99.89±15.12 799.99±15.12人參皂苷Rg1組 1.50±0.32 118.34±18.94 781.53±18.94連翹酯苷高劑量組 1.71±0.31 134.22±21.90 765.65±21.90連翹酯苷低劑量組青年對照組1.65±0.25 128.54±15.98 771.33±15.99

2.2 Morris水迷宮實驗結果 定位航行實驗結果見表2、3。而在探索實驗中，青年對照組、老年對照組、模型組、安理申組、人參皂苷Rg1組、連翹酯苷高劑量組、連翹酯苷低劑量組穿臺次數分別為(0.94±0.14)、(0.72±0.14)、(0.50±0.13)、(0.61±0.13)、(0.50±0.75)、(1.00±0.18)、(1.04±0.22)次。與青年對照組比較，模型組小鼠在目標象限穿臺次數減少(P＜0.05)。長期給予小鼠連翹酯苷可明顯增加小鼠穿臺次數(P＜0.05)，改善小鼠空間探索能力;而安理申和人參皂苷Rg1的穿臺次數與模型組比較并未出現顯著性差異。

表2 連翹酯苷對Aβ25-35導致的學習記憶障礙小鼠游出率的影響(±s，n=10)

表2 連翹酯苷對Aβ25-35導致的學習記憶障礙小鼠游出率的影響(±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 0.50±0.19 0.63±0.18 0.38±0.18 0.78±0.15 0.88±0.13老年對照組 0.13±0.13 0.50±0.19 0.63±0.18 0.88±0.13* 0.88±0.13*模型組 0.00±0.00# 0.14±0.14 0.57±0.20 0.43±0.20 0.43±0.20#安理申組 0.50±0.22* 0.83±0.17* 0.50±0.22 0.83±0.17 0.83±0.17人參皂苷Rg1組 0.43±0.20 0.57±0.20 0.43±0.20 0.71±0.18 1.00±0.00*連翹酯苷高劑量組 0.14±0.14 0.43±0.20 0.75±0.16 1.00±0.00* 0.86±0.14*連翹酯苷低劑量組 0.33±0.21 0.17±0.17 0.83±0.17 0.83±0.17 1.00±0.00*

表3 連翹酯苷對Aβ25-35導致的學習記憶障礙小鼠潛伏期的影響(s，±s，n=10)

表3 連翹酯苷對Aβ25-35導致的學習記憶障礙小鼠潛伏期的影響(s，±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 94.00±13.88 65.79±17.48 74.27±18.42 24.03±7.33 20.23±7.60老年對照組 109.67±9.64 78.27±15.78 78.03±19.69 36.39±9.43* 36.94±11.48*模型組 119.29±0.11 106.92±12.35# 109.10±10.13 98.75±13.26# 90.12±18.43#安理申組 85.47±15.68* 69.52±11.76 75.86±24.48 41.44±11.75* 49.94±19.64人參皂苷Rg1組 99.90±11.32 89.87±14.27 84.87±18.08 48.34±18.33* 39.85±11.45*連翹酯苷高劑量組 115.89±3.37 102.11±11.42 75.96±14.86 33.77±10.01* 34.11±5.47*連翹酯苷低劑量組 102.66±12.49 105.00±14.12 76.77±13.77 34.50±12.41* 38.02±15.64*

2.3 腦組織生化指標檢測 見表4、5。

表4 腦組織海馬AchE、ChAT、SOD活力檢測結果(±s，n=10)

表4 腦組織海馬AchE、ChAT、SOD活力檢測結果(±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別AchE (U/mg prot) ChAT (U/mg prot) SOD (U/mg prot) 4.06±0.29 128.19±5.73 115.37±10.24老年對照組 4.47±0.34 81.09±12.08# 111.96±4.29模型組 5.69±0.56# 73.60±11.27# 97.46±3.83#安理申組 4.69±0.10 87.56±22.15 112.85±5.20人參皂苷Rg1組 5.24±0.42 107.33±20.12 135.52±4.25*連翹酯苷高劑量組 4.01±0.40* 128.64±12.88* 119.42±6.01*連翹酯苷低劑量組 4.90±0.27 108.10±10.42* 117.51±5.45青年對照組*

3 討論

AD由巴伐利亞的神經病理學家Alois Alzheimer 1907年首先發現。AD是一種神經系統退行性疾病，在臨床上主要表現為進行性記憶力減退和智力下降。病理特征主要以老年斑、神經細胞內的神經纖維纏結、淀粉樣蛋白(Aβ)沉積以及神經元空泡變性和大量喪失為主。

Aβ級聯假說認為Aβ在腦內沉積是AD的一個主要病理特征，現已公認Aβ是引起AD的主要因素，使用Aβ來造成AD的模型成為理想的研究AD的途徑［4］，在AD藥物篩選中應用廣泛。本課題選用右側側腦室注射Aβ25-35建立擬AD動物模型，其優點是可以模擬AD的學習記憶障礙、炎癥反應和神經元損傷等行為學和病理學方面的特征。另外，劉克明等［5，6］報道，在行為學試驗中，自然衰老小鼠(15月齡)水迷宮逃避潛伏期明顯延長，說明其學習記憶能力減退，腦組織腎上腺素和組織多巴胺均降低。因此，相對于年輕小鼠腦室注射Aβ模型來說，本實驗在衰老的基礎上給予Aβ損傷模型更符合老年癡呆臨床基礎，在AD藥物篩選中更具有說服力。

表5 腦組織皮層AchE、ChAT、SOD、MAO活力及MDA含量檢測結果(±s，n=10)

表5 腦組織皮層AchE、ChAT、SOD、MAO活力及MDA含量檢測結果(±s，n=10)

注:與青年對照組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05

組別AchE (U/mg prot) ChAT (U/mg prot) SOD (U/mg prot) MAO (U/mg prot) MDA (U/mg prot)青年對照組 6.01±0.61 38.03±2.73 56.86±1.96 17.76±0.1913.87±2.15老年對照組 6.18±0.26 26.13±1.87# 46.72±1.06# 18.30±1.93 15.01±1.83模型組 8.00±0.49# 14.39±1.19# 49.53±1.16# 24.05±0.43# 26.26±2.26#安理申組 6.56±1.16 27.27±7.13* 54.46±1.63* 19.11±1.27* 17.81±2.07*人參皂苷Rg1組 5.30±0.34* 34.16±4.84* 48.86±3.14 23.81±0.64 14.80±1.24*連翹酯苷高劑量組 6.28±0.32* 30.07±3.23* 55.28±2.17* 16.64±0.56* 17.34±1.12*連翹酯苷低劑量組 7.39±0.49 24.34±1.63 51.86±0.47 17.36±2.54*21.94±0.53

從水迷宮實驗結果來看，Aβ25-35側腦室注射復合自然衰老模型小鼠游出率明顯下降，逃避潛伏期明顯延長，在空間探索實驗中小鼠穿越原平臺次數減少，小鼠的學習記憶能力明顯下降，而沒有接受Aβ25-35損傷的12月齡自然衰老小鼠學習記憶能力有所下降，但與2月齡年輕小鼠沒有統計學差異。而連翹酯苷可明顯提高模型組小鼠的游出率，縮短逃避潛伏期，增加穿臺次數。從行為學的角度可以看出，連翹酯苷可以改善模型組小鼠的學習記憶能力。同時安理申和人參皂苷Rg1在水迷宮實驗中也可不同程度的改善模型組小鼠的學習記憶能力。

衰老過程中，神經元細胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化可產生大量自由基，引發鏈式脂質過氧化反應損傷細胞膜，進而使細胞凋亡。同時氧自由基造成的氧化應激能促進Tau蛋白的異常磷酸化，導致神經纖維纏結，進而促使AD的形成［7］。SOD是機體清除自由基的重要酶類，其作用主要是催化生物氧化產生超氧自由基，清除并阻止由氧自由基引發的自由基連鎖反應。MDA是自由基對生物細胞膜損傷的主要代謝產物，能使生物膜變性、壞死，使DNA發生突變、交鏈，同時使SOD活性降低，而造成自由基連鎖反應的惡性循環［8］。實驗結果顯示連翹酯苷可以顯著地提高模型組小鼠腦組織海馬、皮層中SOD的活性，同時降低模型組小鼠腦組織皮層中MDA的活性。提示連翹酯苷可以通過抑制氧自由基的形成，改善模型動物的學習記憶能力。同時安理申和人參皂苷Rg1也可以不同程度的改善這兩個指標。

海馬與大腦皮質投射的基底前區腦膽堿能系統神經元及突觸的大量損傷、喪失是AD患者記憶、認知能力減退的主要原因。AchE和ChAT是反映中樞膽堿能系統代謝的一對特異性酶，兩者活性直接影響腦內興奮性遞質乙酰膽堿(Ach)的含量［9］。實驗結果顯示連翹酯苷可以使模型組小鼠腦組織海馬、皮層中ChAT的活性顯著升高，同時顯著地降低AchE的活性。從而改善了改善膽堿能系統，增加腦內Ach水平，從而提高膽堿能神經元的興奮性，提高了學習記憶能力。同時安理申和人參皂苷Rg1也可以不同程度的改善這兩個指標。

MAO是大腦周圍神經組織中一種十分重要的酶，不僅能提高有害的H2O2的水平，而且是代謝多巴胺、去甲腎上腺素與腎上腺素等兒茶酚胺遞質類的重要酶，可以使單胺類神經遞質含量下降，促進神經系統的老化過程。所以MAO活性表達變化，也可在一定程度上反映中樞神經系統單胺能神經—兒茶酚胺類神經遞質系統的功能狀況。實驗結果顯示連翹酯苷和安理申可以顯著地使模型組小鼠腦組織皮層中MAO的活力下降，提示連翹酯苷AD小鼠腦神經遞質可能具有重要的保護作用。

綜上所述，連翹酯苷對AD模型小鼠的學習記憶障礙具有改善作用，可能是連翹酯苷的抗氧化作用和調節神經遞質代謝系統綜合效應的結果。本實驗為以后對連翹酯苷在抗老年癡呆新藥研制中提供了依據。

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