常規HPLC法檢驗中藥常見問題的探討

黎進平

四川省攀枝花市食品藥品檢驗所，四川攀枝花 617000

常規HPLC法檢驗中藥常見問題的探討

黎進平

四川省攀枝花市食品藥品檢驗所，四川攀枝花 617000

目的 探討常規高效液相色譜（HPLC）法（ODS柱，紫外檢測器）檢驗中藥中遇到的常見問題。 方法 結合筆者近幾年檢驗工作的實踐和經驗來展開分析討論。 結果 提出了解決常見問題的方法和對策。 結論 具體問題要具體分析，合理調整可變的檢驗條件是解決問題的重要途徑。

中藥；HPLC；藥品檢驗

高效液相色譜（HPLC）法是一種同時具有分離、分析功能和快速、高效、靈敏等優點的檢測技術，現已成為藥品分離、鑒定和含量測定的首選方法[1]。運用HPLC法進行中藥檢驗時，最常規的檢測條件是十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）為填充劑的色譜柱和紫外檢測器[2]。在《中國藥典》一部中，很多品種也都采用了常規HPLC法來檢驗。筆者就自己在運用該法檢驗中藥時遇到的幾個常見問題，結合工作實踐，談談自己的看法，希望能對中藥檢驗工作者，特別是接觸檢驗工作不久的人員提供參考和幫助，以便在遇到類似問題時，容易找到解決的思路和方向，使問題能及時準確地處理，也為檢驗工作的順利推進起到積極作用。

1 對照品峰被分成2個的問題

常規HPLC法檢驗中藥中，單一的對照品應該只出1個峰，但有時會出現對照品峰被分成2個的情況，如果遇到這樣的問題，筆者認為，不要急于更換色譜柱或調整流動相，可以先考慮減少進樣量再進1針，有可能是樣量過載。比如筆者在做刺五加片[3]489（多多藥業有限公司，批號：1005091）的含量測定時，設定的檢驗條件：Kromasil 100-5 C18柱，柱溫35℃，流動相各組分比例與標準相同，流速0.95 mL/min，進樣10 μL，對照品紫丁香苷峰被分成2個，小峰在左側。在其他條件不變的情況下，將進樣量改進5 μL，則峰型正常；在做九味羌活顆粒[4]449（九寨溝天然藥業集團有限責任公司，批號：110302）的含量測定時，設定檢驗條件Kromasil 100-5 C18柱，柱溫35℃，流動相各組分比例與標準相同，流速1.00 mL/min，進樣20 μL，對照品黃芩苷峰被分成2個，小峰在左側，同樣只將進樣量改為10 μL，則峰型正常。如果減少進樣量仍不能解決，再考慮更換其他品牌的色譜柱，如果沒有多余色譜柱，則可試做其他品種，觀察其他對照品是否出現類似情況。筆者多年的實踐發現，色譜柱使用多年后或損壞時，會將對照品峰分成2個，小峰多在右側。這時可以采取有把握的反沖色譜柱或不同極性有機溶劑長時緩沖色譜柱，盡可能使色譜柱再生。

2 理論板數不能滿足要求

在《中國藥典》2010年版一部中，理論板數是色譜系統適應性的重要指標，明確規定了其下限。檢驗時有時候會出現理論板數低于下限值。這時先觀察理論板數的實際值與規定最小值相差多少，如果不是太大，可通過減少進樣量來有效提高理論板數，減少進樣量也就減小了半峰寬，根據理論板數的計算公式知當保留時間不變的情況下，半峰寬減小，理論板數增大。如果相差較大，減少進樣量也不能滿足要求，再考慮更換色譜柱、調整流動相、柱溫。

3 分離度不能滿足要求

在《中國藥典》2010年版一部中，分離度也是色譜系統適應性的一個指標，檢驗時有時會出現兩個物質不能有效分離，如果遇這種情況，筆者認為可以考慮更換色譜柱，這樣既簡捷也比較有效。不同品牌、規格的色譜柱有各自的特點，對同一物質的洗脫分離能力各不相同。比如筆者在做生脈注射液[5]（四川省宜賓五糧液集團宜賓制藥有限責任公司，批號：10082011）的含量測定時，設定的檢驗條件：菲羅門Luna柱，柱溫35℃，流動相各組分比例與標準相同，流速1.60 mL/min，進樣20 μL；人參皂苷Rg1與人參皂苷Re不能有效分離。將檢驗條件改為菲羅門Gemini柱，柱溫40℃，其他條件不變，則分離度達到要求?；蛘邔z驗條件改為Kromasil 100-5 C18柱，其他條件不變，則分離度也能達到要求。如果沒有多余的色譜柱，可以多次調整流動相的比例，通過改變流動相的極性，使被測物質峰的分離度達到要求。

通常情況下，進針都是先進對照品再進供試品，但由于有時會出現供試品中被測物質峰與雜質峰分離度不能滿足要求，而使前面對照品進針不能使用的情況，所以對于第一次做的品種，檢驗開始最好先進一針對照品再進一針供試品，以確定檢驗條件二者都能滿足后，再按常規完成進針。

4 供試品中被測物質峰面積突然增大或峰型異常

在檢驗過程，有時供試品中被測物質峰會突然出現峰面積增大，或峰型異常。比如筆者在做通竅鼻炎片[4]1057-1058（中山市中智制藥有限公司，批號：20091236）、羚羊感冒片[3]608（黑龍江天宏藥業有限公司，批號：20080201）、抗感顆粒[3]471（四川好醫生攀西藥業有限責任公司，批號：080807）的含量測定時，就出現過這種情況。筆者多次實驗后發現，這種情況主要是由于供試品中雜質峰干擾導致，供試品的前幾針多不會出現這種情況，一般在第5、6針時開始出現，是由于前面供試品中一些在該波長下有吸收的雜質一針一針的逐漸從色譜柱中洗脫下來，碰巧出現在被測物質出峰的時間段內，與被測物質峰完全重疊，則峰面積增大，不完全重疊則影響被測物質峰型而出現峰型異常。遇到這種情況，筆者認為要認真分析前面的色譜圖，找出雜質峰出峰的規律，找到合適的時間進針，避開雜質峰就可以了。當然也可以等待，不再進針，讓干擾雜質全部流出后再進針。比如筆者在做復方黃連素片[4]923（成都森科制藥有限公司，國藥準字Z51021798）中芍藥苷的含量測定時，按常規操作供試品通常在進第5或6針時，出現強吸收且亂的雜質峰（多個廠家生產的該品種都出現類似的情況）。由于雜質峰干擾嚴重，很難有效避開雜質峰，多進一針很可能會增加更多等待時間。其次想讓雜質峰出的更快些，如果用甲醇、乙腈沖柱，一定要用5%～10%甲醇過渡，因為流動相中含磷酸二氫鉀，防止鹽析出而導致儀器故障，當然來回平衡流動相也很費時間。

5 其他問題

檢驗中，有時會出現被測物質的保留時間較長。這時，筆者認為可以考慮在滿足被測物質分離度的條件下縮短被測物質的保留時間，加快檢驗的完成，節約時間，減少人力、物力的消耗?？s短被測物質的保留時間最常見的方法就是調整流動相各組分比例、升高柱溫、增加流速，其中以調整流動相組分比例的效果最為顯著。由于藥典中使用的色譜柱多要求為以ODS為填充劑，屬于反相色譜柱，所以合理增加流動相中甲醇或乙腈的比例，一般都能縮短被測物質的保留時間。比如筆者在做復方丹參片[3]527（深圳同安藥業有限公司，批號：080702）中丹參酮ⅡA的含量測定時，用菲羅門Luna柱，流動相組分比例由標準中的比例調整為甲醇-水（75∶25）；做生脈注射液[5]（四川省宜賓五糧液集團宜賓制藥有限責任公司，批號：10082023）含量測定時，用菲羅門 Gemini柱，流動相各組分比例由標準中的比例調整為乙腈-0.05%磷酸溶液（21∶81）；通過調整，它們都能縮短被測物質的保留時間，且滿足藥典要求。

有時還會遇到被測物質出峰時基線較高，色譜圖質量不佳的情況，這時，筆者認為可以考慮減小進樣量來優化檢驗工作。比如筆者在做生脈注射液[5]（四川省宜賓五糧液集團宜賓制藥有限責任公司，批號：10082011）含量測定時，設定檢驗條件：Kromasil 100-5 C18柱，柱溫30℃，流動相各組分比例與標準同。按標準操作供試品濃縮5倍，進樣20 μL，濃縮后的供試品顏色深，這時色譜圖上顯示人參皂苷Rg1、人參皂苷Re出峰時，峰起點被抬至23 mV左右。如果將進樣量調整為5 μL，則出峰時基線略抬高，峰面積波動更小，色譜圖質量提高了，相對標準偏差也更容易滿足要求。

6 小結

《中國藥典》2010年版規定：各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變[4]附錄36。合理調整這些可變的檢驗條件是解決問題的重要途徑。如何準確設定檢驗條件，除了在檢驗工作中不斷積累經驗外，查閱藥典、期刊雜志、專業書籍也非常重要，這樣不但可以了解同一被測物質還有那些不同檢測條件，豐富檢驗知識，更為檢驗條件設定提供參考和借鑒。

[1]凌志甫，陳博，龐裕玉，等.高效液相色譜法在藥品“打假”中的應用[J].中國醫藥導報，2009，6（7）：131-132.

[2]劉月娥，黃安軍.基層實驗室高效液相色譜儀的常見問題與對策[J].西北藥學雜志，2010，25（4）：310-312.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：化學工業出版社，2005.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[5]國家藥典委員會.中國衛生部藥品標準（WS3-B-2865-98）[S].北京：人民衛生出版社，2011：51.

Discussion on common problems in traditional Chinese medicine inspection with conventional HPLC method

LI Jinping
Institute for Food and Drug Control in Panzhihua City,Sichuan Province,Panzhihua 617000,China

ObjectiveTo discusse the common problems encountered during traditional Chinese medicine inspection with conventional High Performance Liquid Chromatography method(ODS column,ultraviolet detector).MethodsThese problems were analyzed with years of practices and experiences of the author in drug inspection.ResultsMethods and countermeasures were put forward to dissolve these common problems.ConclusionWith the problems tackled case-by-case,reasonable adjustment of variable inspection conditions is an important way for problem solving.

Traditional Chinese medicine;HPLC;Drug inspection

R927.2

C

1673-7210（2012）08（c）-0152-02

2012-03-31 本文編輯：衛 軻）