HPLC法測定西藏野生和人工種植喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿

劉 青， 達(dá)瓦潘多， 央 美， 頓珠次仁， 仁 增， 索朗其美

(西藏藏醫(yī)學(xué)院，西藏拉薩850000)

喜馬拉雅紫茉莉 (巴朱)為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉 Mirabilis himalaica(Edegw．)Heim．的干燥根［1］。該藏藥具有溫腎、益腎滋補、生肌、利尿、排石等功效，用于胃寒、腎寒、下身寒、陽萎浮腫等［1-3］，喜馬拉雅紫茉莉作為藏藥使用歷史悠久，始見于《月王藥珍》［4］，藏醫(yī)藥名著《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》均有記載［2-5］。對于紫茉莉?qū)僦参锔泻锌怪参锊《尽⒖咕牡鞍壮煞帧被帷⒂袡C酸、豆甾醇、β-谷甾醇、葫蘆巴堿、半乳糖、淀粉、樹脂等和揮發(fā)油成分［6-11］早有研究報道。作為藏藥藥用的紫茉莉?qū)僦参锵柴R拉雅紫茉莉在臨床應(yīng)用范圍廣，臨床上常見的十五味兒茶丸、巴桑母酥油丸、二十五味鬼臼丸、熱巴羅布膏等劑型作為主要的原料之一，資源緊缺，屬于藏藥瀕危物種之一。2003年由西藏藏醫(yī)學(xué)院索朗其美教授主持的人工種植喜馬拉雅紫茉莉作為西藏高原瀕危藏藥材人工種植栽培技術(shù)項目之一，并獲得該種植技術(shù)的項目專利，于2006年順利通過西藏自治區(qū)科技廳結(jié)題驗收。為保證喜馬拉雅紫茉莉用于臨床品種的質(zhì)量，對野生和人工種植喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿［10］進(jìn)行定量測定［11］。

1 儀器與材料

梅特勒AE200電子天平;島津LC—20A液相色譜儀，配SPD—20AV紫外可見檢測器;ASI0200BDT超聲波清洗器 (250W，天津奧特賽恩斯儀器有限公司);UV—2100紫外可見分光光度計 (北京萊伯泰科技儀器有限公司)。乙酸、甲醇 (色譜純)，乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher公司);優(yōu)普超純水機 (蒸餾水自制)。葫蘆巴堿 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110813-200502)。喜馬拉雅紫茉莉野生和人工種植品由西藏藏醫(yī)學(xué)院研究所提供，經(jīng)西藏藏醫(yī)學(xué)院科研所索朗其美教授鑒定為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edegw．)Heim．的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)，柱溫40℃;體積流量0.8 mL/min;檢測波長265 nm。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇8 mL，20℃超聲處理 (功率250 W，頻率55 kHz)40 min，靜置室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取葫蘆巴堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含13.75 μg的溶液，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取上述對照品溶液及供試品溶液，照2.1項下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，測得HPLC圖譜，見圖1。理論塔板數(shù)按葫蘆巴堿峰計算不低于4 000。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密配制系列質(zhì)量濃度的葫蘆巴堿對照 品 溶 液:3.44、13.75、31.43、55.00、110.00 μg/mL，分別精密進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，計算，得回歸方程為:y=8.008 41×10－5x+1.702 816，相關(guān)系數(shù)R=0.999 8，表明葫蘆巴堿在3.44～110 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密量取葫蘆巴堿對照品溶液10 μL(13.75 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣 5次，測定其峰面積，RSD為1.43%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品 (批號2011092301)按2.2項方法制備，分別在0、2、4、6、10、12 h測定，結(jié)果葫蘆巴堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.42%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取樣品 (批號2011092301)樣品6份，按2.2項制備，制得6份供試品溶液，按樣品測定法測定峰面積，測得供試品中葫蘆巴堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21 mg/g(RSD=1.8%，n=6)，表明本法重復(fù)性較好。

圖1 高效液相色譜圖

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取適量的已測知含有量的樣品 (葫蘆巴堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.260 4 mg/g;批號2011092302)6份，分為低、中、高3組，分別精密加入葫蘆巴堿對照品溶液 13.75 μg/mL、20 μg/mL、25.88 μg/mL各1 mL，按2.2項制樣并測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果

2.10 樣品測定 取野生及人工種植藥材 (各3份)，按上述色譜條件測定，計算其中葫蘆巴堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果 (n=6)

3 討論

根據(jù)參考文獻(xiàn)，宋粉云等［12］采用HPLC法測定了紫茉莉根中葫蘆巴堿。結(jié)合多次的實驗條件摸索，比較不同比例 的 乙 腈-0.03% 乙 酸 (20∶80)、乙 腈-0.03% 乙 酸(10∶90)、乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)等流動相系統(tǒng)對葫蘆巴堿峰與雜質(zhì)峰的分離度、保留時間、理論板數(shù)等的影響。發(fā)現(xiàn)流動相乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)能保證葫蘆巴堿峰與雜質(zhì)峰的分離度、理論板數(shù)均達(dá)到較好;比較了葫蘆巴堿于265 nm及214 nm處的吸光度值，結(jié)果在265 nm處有較高的吸收。

現(xiàn)代藥理研究表明，葫蘆巴堿是一種兩性化合物，以內(nèi)鹽的形式存在。葫蘆巴堿不但具有抗腫瘤的活性，也是一種具有降低血糖功效的活性物質(zhì)［13］，針對上述藥理作用，人工種植喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿的量高于野生喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿的量。對于其它的主要成分，將進(jìn)一步的比較和研究，為藏藥喜馬拉雅紫茉莉在臨床上合理、有效、安全使用提供理論依據(jù)。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥．第一冊［S］．1995:104．

［2］中國科學(xué)院西北高原生物研究所．藏藥志［M］．西寧:青海人民出版社，1991:461．

［3］青海省藥品檢驗所，青海省藏醫(yī)藥研究所．中國藏藥:第一卷［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996:303．

［4］衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所．中國民族藥志:第二卷［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，1990:348．

［5］宇妥·元丹貢布．四部醫(yī)典［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1987:165．

［6］李光喜，楊培全．紫茉莉?qū)偎幱弥参镅芯窟M(jìn)展［J］．廣東醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，1994，10(4):251-253．

［7］Ahmad M S，Ranf A，Mustafa J，et al．An 8-hyydroxy octadeca-CIS-11，14-dienoic from Mirabilis jalapa seed oil［J］．Phyto Chem，1984，23:2247-2249．

［8］危 英，楊小生，郝小江，等．紫茉莉根的化學(xué)成分［J］．中國中藥雜志，2003，28(12):1151-1152．

［9］Ghosh T K，Rao C C．Some structural features of the Dglucan from the seed of Mirabilis jalapa［J］．Carbohydr Res，1981，90:243．

［10］王 琳，楊德成，江金霖，等．紫茉莉?qū)僦参锏幕瘜W(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展［J］．中國民族民間醫(yī)藥，2010，19(7):31-34．

［11］鞏 江，王聰聰，倪土峰，等．國產(chǎn)紫茉莉?qū)僦参锼帉W(xué)研究［J］安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2009，37(13):5959-5960．

［12］宋粉云，張德志，鐘遠(yuǎn)香，等．HPLC法測定紫茉莉根中葫蘆巴堿的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2005，16(3):189-191．

［13］趙懷清，曲 燕，王學(xué)婭，等．葫蘆巴堿的HPLC法測定及藥代動力學(xué)研究［J］．藥學(xué)學(xué)報，2003，38(4):279-282．