RP-HPLC法同時測定內異消大鼠血漿中各成分

馮彬彬， 張建海， 李金玲， 徐曉玉*

(1.重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 404120;2.西南大學，重慶 400716)

內異消是本課題組研制開發的用于治療子宮內膜異位癥的中藥新藥，由川芎、當歸、延胡索等藥材組成。川芎嗪 (tetramethylpyrazine，TMPZ)是川芎中的一種活性生物堿成分，可以改善微循環，并對心血管疾病有著顯著的療效［1］;阿魏酸 (ferulic acid，FA)是當歸、川芎中的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、鎮靜、抑制血小板聚集及抗血栓形成等作用［2］;延胡索乙素 (Tetrahydropalmatine，TET)是中藥延胡索中所含具有鎮痛作用的有效成分［1］。對川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素單一成分的HPLC的測定有較多報道［3-9］，但是采用HPLC法同時測定性質差別較大的川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素尚無報道。本實驗建立了同時測定川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的RP-HPLC法，為內異消的質量控制提供實驗依據。

1 材料、儀器和藥品

1.1 儀器和藥品 美國Agilent1200(智能柱溫箱;MWV紫外檢測器);H1650—W臺式微量高速離心機 (長沙湘儀離心機儀器有限公司);EL—204電子天平 ［梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司］;WH—2微型渦旋混合儀 (上海滬西分析儀器廠);Millipore純水系統。甲醇為色譜純(購自迪馬公司);冰醋酸為分析純;水為去離子水;阿魏酸對照品 (批號:110773-200611)、川芎嗪對照品 (批號:110817-200305)、延胡索乙素對照品 (批號:110726-200610)(均購自中國藥品生物制品檢定所);香豆素對照品 (購自Sigma公司);阿魏酸原料藥、川芎嗪原料藥、延胡索乙素原料藥 (購自南京澤朗有限責任公司，純度均在95%以上)。

1.2 動物 SD大鼠，清潔級，雌性，體質量為 (220±20)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(渝)2007-0001。

2 方法和結果

2.1 對照溶液的配制 取川芎嗪對照品15 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，得川芎嗪貯備液質量濃度為0.15 mg/mL;同樣方法配制阿魏酸貯備液質量濃度為0.5 mg/mL，延胡索乙素貯備液質量濃度為0.66 mg/mL;香豆素貯備液質量濃度為0.73 mg/mL，將上述香豆素貯備液稀釋至13.687 5μg/mL。

2.2 色譜條件 Agilent SB-C18ODS色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為甲醇-0.3%冰醋酸 (42∶58);體積流量1.0 mL/min;檢測波長280 nm;溫度30℃。

2.3 生物樣品預處理和測定方法專屬性考察 精密吸取大鼠血漿樣品100μL，加150μL內標和150μL甲醇，渦旋震蕩2 min，沉淀蛋白，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22μm微孔濾膜，取10μL進樣，并按2.2項下色譜條件進行分析。按上述血漿樣品處理方法處理空白血漿加內標、川芎嗪對照溶液、阿魏酸對照溶液、延胡索乙素對照溶液加內標及灌胃內異消制劑的大鼠血漿樣品加內標，分別繪制HPLC色譜圖(見圖1)。

圖1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的專屬性考察色譜圖

實驗結果表明:在2.2項色譜條件下，川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素與內標 (香豆素)及血液內源物質色譜峰分離良好，無明顯干擾峰出現，血漿中雜質對藥物質量濃度的測定無干擾。說明本色譜條件可行。

2.4 標準曲線及線性范圍 精密吸取8份大鼠空白血漿各100μL，分別精密加入50μL不同質量濃度的川芎嗪對照溶液、50μL不同質量濃度的阿魏酸對照溶液、50μL不同質量濃度的延胡索乙素對照溶液和上述相同質量濃度的香豆素內標150μL，制成含川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素各成分分別為0.035 1、0.140 6、0.562 5、1.057 0、2.109 6、4.219 0、8.438 0、16.875 0 μg/mL;0.032 2、0.128 8、0.515 0、1.030 0、2.060 0、4.120 0、8.240 0、16.480 0 μg/mL 和 0.016 1、0.064 6、0.258 3、0.516 5、1.033 3、2.065 0、4.130 0、8.250 0μg/mL的系列質量濃度，按照2.3項進行處理和測定，分別以川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素和內標的峰面積之比與川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素質量濃度做回歸方程，繪制標準曲線，得到復方藥物各成分的回歸方程，川芎嗪為:y=0.031 8x+0.014，r=0.999 6;阿魏酸為:y=0.640 5x－0.068 6，r=0.999 8;延胡索乙素為:y=0.149 1x+0.018 6，r=0.999 5。結果表明，川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素分別在0.035 1～16.875 0、0.032 2～16.480 0μg/mL和0.016 1～8.250μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

2.5 加樣回收率試驗 精密吸取大鼠空白血漿100μL，分別加入低、中、高不同質量濃度的川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素標準溶液各50μL，再加入150μL相同質量濃度香豆素溶液，每個質量濃度平行3份，配制成川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素質量濃度分別為2.109 6、4.219 0、8.475 0 μg/mL;2.060 0、4.120 0、8.480 0 μg/mL 和 1.133 0、3.854 0、6.780 0μg/mL的3個質量濃度，按2.3項生物樣品預處理方法處理，每份樣品平行進樣3次，代入各自標準曲線分別計算川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素在血漿中的質量濃度，并計算加樣回收率。計算結果見表1。

由表1可以看出川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素平均回收率均在80%～120%之間，RSD均小于10%，表明該方法加樣回收率符合生物樣品要求。

2.6 精密度試驗 樣品配制同2.5項下方法，每份樣品平行進樣5次，各以1 d內測得的各物質濃度計算日內精密度，以1周內3次配制測定的各物質計算日間精密度。計算各成分含有量，結果見表2～表4。

表1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的加樣回收率 (±s，n=3)

表1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的加樣回收率 (±s，n=3)

川芎嗪/(μg·mL－1)平均回收率/%RSD/% 阿魏酸/(μg·mL－1)平均回收率/%RSD/% 延胡索乙素/(μg·mL－1)平均回收率/% RSD/%2.109 6 108.80±0.06 5.85 2.06 113.46±0.07 6.191.133 97.78±0.04 4.05 4.219 104.22±0.06 5.34 4.12 110.43±0.01 0.60 3.854 97.34±0.03 3.36 8.475 96.66±0.02 1.86 8.48 98.77±0.01 1.30 6.780 99.88±0.01 1.39

表2 川芎嗪精密度 (±s，n=5)

表2 川芎嗪精密度 (±s，n=5)

質量濃度/(μg·mL－1)日內日間樣品平均質量濃度/(μg·mL－1) RSD/% 樣品平均質量濃度/(μg·mL－1) RSD/%2.109 6 2.707 8±0.122 8 4.53 2.800 2±0.358 4 12.8 5.645 6.126 6±0.403 8 6.59 5.744 2±0.395 8 6.89 8.475 8.358 0±0.286 4 3.43 8.451 8±0.280 4 3.32

表3 阿魏酸精密度 (±s，n=5)

表3 阿魏酸精密度 (±s，n=5)

質量濃度/(μg·mL－1)日內日間樣品平均質量濃度/(μg·mL－1) RSD/% 樣品平均質量濃度/(μg·mL－1) RSD/%2.06 2.570 7±0.209 4 8.15 2.527 5±0.192 8 7.63 5.65 5.413 7±0.175 1 3.24 5.074 6±0.072 2 1.42 8.48 8.360 7±0.186 7 2.23 8.329 7±0.283 2 3.40

表4 延胡索乙素精密度 (±s，n=5)

表4 延胡索乙素精密度 (±s，n=5)

質量濃度/(μg·mL－1)日內日間樣品平均質量濃度/(μg·mL－1) RSD/% 樣品平均質量濃度/(μg·mL－1) RSD/%1.13 1.374 2±0.074 6 5.43 1.364 4±0.068 8 5.04 3.35 3.558 5±0.351 5 9.88 3.180 0±0.294 6 9.26 5.12 5.287 0±0.245 2 4.64 5.105 3±0.307 6 6.02

由表2、3、4可以看出川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素低質量濃度精密度RSD均小于20%，中、高質量濃度精密度RSD均小于15%，表明精密度良好，符合生物樣品精密度要求。

2.7 穩定性實驗 精密量取空白血漿100μL，分別加入2.1項下各物質中質量濃度對照溶液，配制成含川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素分別為4.219 0、4.120 0和3.854 0μg/mL質量濃度的生物樣品，按照2.3項下方法進行處理，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取樣測定，求得川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素含有量的RSD分別為5.8%、3.4%、4.5%，表明該液在12 h內穩定。

3 討論

3.1 中藥復方進入體內之后，成分為多成分，所以要確定體內成分含有量須建立體內多成分的測定方法。目前對于川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素3種成分同時測定尚無報道，本實驗建立了3種有效成分的同時測定方法，效果令人滿意。

3.2 本實驗選擇相同波長下3種物質的同時測定，采用1種物質作為內標，且流動相選擇了常用的甲醇和冰醋酸，省時、省力、高效、降低成本。本方法既可在常規HPLC條件下單獨測定川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的血藥濃度，亦可用于同時測定3種成分。

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