建湖地區(qū)仔豬黃、白痢病原菌的分離和藥敏試驗

陳廣仁 劉金彪

1.江蘇省建湖縣上岡鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇建湖224733；2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州225009

仔豬黃、白痢是由致病性大腸桿菌（E T E C）引起的常見仔豬急性傳染病，1～3周齡哺乳仔豬最易感，發(fā)病急、傳播快、死亡率高，是困擾養(yǎng)豬生產(chǎn)的疑難病癥。黃、白痢發(fā)病豬以腹瀉為主要特征，糞便呈黃色、乳白色或灰白色漿狀稀便，內(nèi)含凝乳小片，有特殊腥臭味；臨床表現(xiàn)為食欲下降，被毛粗亂，消瘦，眼球下陷，四肢無力；剖檢病變?yōu)槊撍畤?yán)重，腸粘膜呈急性卡他性炎癥變化，腸壁變薄、松弛，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹、有彌漫性出血點，以十二指腸處最為嚴(yán)重。

仔豬發(fā)生黃痢時，常波及整窩仔豬，病死率高達90%以上；發(fā)生白痢時，整窩仔豬發(fā)病率可達30%～80%［1］。仔豬黃、白痢在一些規(guī)模化養(yǎng)豬場經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗用試劑均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；生化培養(yǎng)基由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病學(xué)實驗室提供；慶大霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、氯霉素、強力霉素等14種藥敏紙片，均購自杭州天和生物有限公司。

1.2 病料采集和處理

2011年8月下旬，筆者在建湖某豬場臨診時發(fā)現(xiàn)疑似仔豬黃、白痢的病例。從每窩中選擇典型的發(fā)病仔豬，用棉拭子從腹瀉仔豬的直腸內(nèi)采集糞便，并采集病死豬的十二指腸和腸系膜淋巴結(jié)，記為同一個編號，所采集病料的編號依次為E 81、E 82、E 83、E 84和E 85；然后將棉拭子（需折去多余的棉棒）和其他病料分別放入裝有保存液的不同塑料離心管內(nèi)并蓋緊，做好標(biāo)記（主要包括日期和編號，應(yīng)與登記表一致）后立即放入裝有冰袋的泡沫箱內(nèi)，備用。

1.3 培養(yǎng)基制備

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的制備：取蛋白胨20.0g、乳糖10.0g、氯化鈉5.0g、牛膽鹽5.0g、中性紅25.0 m g、瓊脂粉20.0g，加蒸餾水至1000m L，調(diào)節(jié)p H值至7.2；L B液體培養(yǎng)基的制備：取胰蛋白胨1.0 g、酵母提取物0.5g、氯化鈉1.0g，加蒸餾水至100 m L，調(diào)節(jié)p H值至7.2；L B固體培養(yǎng)基的制備：取胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、氯化鈉1.0g、瓊脂粉1.5g，加蒸餾水至100m L，調(diào)節(jié)p H值至7.2；普通肉湯培養(yǎng)基的制備：取牛肉浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、磷酸氫二鉀0.5g，加蒸餾水至1000m L，調(diào)節(jié)p H值至7.2。

1.4 細菌分離

無菌取1.2采集的病料于麥康凱瓊脂平板上分區(qū)劃線，在37℃有氧條件下培養(yǎng)24h；然后挑取單菌落進行純培養(yǎng)。

1.5 生化反應(yīng)試驗

取經(jīng)分離純化的菌株按常規(guī)方法［2］進行生化試定試驗。

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗按陸承平［3］主編的《獸醫(yī)微生物學(xué)》的圓紙片擴散法操作。取經(jīng)分離純化的單菌落接種于5m L的普通肉湯內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～18h；用L B液體培養(yǎng)基調(diào)制菌懸液，使其達到0.5麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫龋ㄔ?25n m波長處吸光度為0.09～0.10）；用滅菌棉拭子蘸取稀釋后的菌液，均勻涂布在L B固體培養(yǎng)基平板上，靜置5m i n；待平板表面水分吸收后，用眼科鑷按無菌操作要求分別將慶大霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、氯霉素、強力霉素等14種藥敏紙片貼至培養(yǎng)基表面，并用鑷子尖輕壓紙片使其與培養(yǎng)基貼牢，要求紙片間距離≥24mm、紙片與培養(yǎng)皿邊緣距離≥15mm，且每種藥物需貼2個紙片；37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，并計算其平均值。藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離結(jié)果

在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長出大量中等大小、圓形、濕潤、光滑的粉紅色菌落，按常規(guī)方法［4］進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察可見散在排列、紅色、兩端鈍圓、無莢膜的短桿狀革蘭氏陰性菌。

2.2 生化反應(yīng)試驗結(jié)果

分離株E 81、E 82、E 83、E 84和E 85的生化試驗結(jié)果相同，如表2所示。

表2 分離菌株的生化試驗結(jié)果

以上結(jié)果符合埃希氏大腸桿菌生化特性，可基本確定此次分離到的菌株均為大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

各分離株的藥敏試驗結(jié)果，如表3所示。

由表3可知，大腸桿菌分離株對丁胺卡那、頭孢曲松和多粘菌素B高度敏感，對慶大霉素、呋喃妥因和鏈霉素有不同程度敏感，而對其余8種抗菌藥物耐藥。

表3 5株分離株對14種藥物的敏感性 mm

3 討 論

藥敏試驗結(jié)果表明，臨床上分離到的5株大腸桿菌對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、四環(huán)素、強力霉素、氨芐青霉素、磺胺甲基異惡唑和復(fù)方新諾明8種抗菌藥物耐藥，可見臨床上大腸桿菌的耐藥情況十分嚴(yán)重。而分離株表現(xiàn)出對頭孢曲松、丁胺卡那和多粘菌素B高度敏感，說明此類藥物可作為該發(fā)病豬場以及建湖地區(qū)的首選抗菌藥物；其中多粘菌素B雖為常見藥物，但在臨床上使用頻率不高，使得大腸桿菌對此類藥物尚保持較好的敏感性。以上研究表明，大腸桿菌對藥物的耐藥性具有極其復(fù)雜的特征，因此在臨床上為了減少耐藥菌株的出現(xiàn)，應(yīng)采用聯(lián)合用藥和輪換用藥的方式，避免長期使用同種抗菌藥物或小劑量用藥，以免產(chǎn)生大量耐藥菌株。

大腸稈菌是條件性致病菌，當(dāng)環(huán)境條件改變或機體抵抗力降低時，很容易引起動物發(fā)病。大腸桿菌在自然界的普遍存在決定了本病難以根除，因此豬場在發(fā)生仔豬黃、白痢時，一定不要盲目加大藥物的使用劑量或一次使用多種藥物，而要根據(jù)本場仔豬發(fā)病特點以及藥敏試驗結(jié)果，選擇適合本場的敏感藥物。同時，要保持豬舍清潔衛(wèi)生，合理使用疫苗和微生態(tài)制劑，并進行科學(xué)的飼養(yǎng)管理。

［1］ 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)［M］.第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［2］ 廖延雄.獸醫(yī)微生物實驗診斷手冊［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995.

［3］ 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［4］ 武三孝.仔豬水腫病大腸桿菌的分離鑒定及復(fù)制的研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，1992（2）：59.