知母多酚對血管內皮的保護作用

嚴 犇,劉 康,劉保林,黃 芳

中國藥科大學中藥藥理實驗室，南京 211198

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge.）的干燥根莖，具有抗菌解熱、降糖、降脂、抑制血小板聚集等作用。知母多酚（total phenol of Anemarrhena asphodeloides，TPAA）為其主要活性組分。體內研究發現[1-2]，知母多酚能顯著降低糖尿病動物的血糖。本文通過知母多酚對內皮保護作用的研究，探討其改善糖尿病心血管并發癥的作用。

1 實驗材料

1.1 藥物及試劑

知母購自安徽亳州藥材市場，經南京中醫藥大學生藥教研室吳啟南副教授鑒定確認。知母用10倍量水煎煮2次，每次1h，放冷，過濾，濃縮至1 g· mL-1，加乙醇至含醇70%，過濾，回收乙醇，得流浸膏，再加水稀釋至0.5 g·mL-1、調pH值為3，正丁醇1/3體積萃取3次，得正丁醇層，調pH值為7，以水1/3體積萃取3次，得水層，調pH值為3，正丁醇1/ 3體積萃取3次，回收正丁醇，得知母多酚，收率為2%。以芒果苷（蘇州思源天然產物研發有限公司贈送，純度99.5%以上）為對照，酒石酸亞鐵反應比色法測定總酚含量為80%。經HPLC法測得，多酚中主要成分為芒果苷和新芒果苷，見圖1。

牛血清白蛋白（BSA，南京生興生物技術有限公司，批號：8C248C24）；棕櫚酸（palmitic acid，PA），用無水乙醇溶解、10%BSA稀釋成相應濃度；胰島素注射液 （江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號：1103240）；重酒石酸去甲腎上腺素注射液（NE，天津金耀氨基酸有限公司）；乙酰膽堿（Ach）、水楊酸鈉、D-葡萄糖、果糖、疊氮鈉均為分析純。

圖1 知母多酚HPLC測定結果峰13為芒果苷，峰7為新芒果苷

人臍靜脈血管內皮細胞株（HUVEC），購于南京凱基生物有限公司。胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、DMEM培養基，Gibco公司產品。ELISA試劑盒，進口分裝，南京迪兆生物科技有限公司提供。

1.2 實驗動物

SD大鼠，雄性，購自揚州大學比較醫學中心，合格證號：0002359；動物分籠飼養，保持晝夜節律在室溫22±2℃中自由攝食和飲水。

1.3 儀器

JH-2肌張力傳感器、HW-400SE恒溫平滑肌槽、BL-420生物機能實驗系統 （成都泰盟科技有限公司產品）；RF-5301PC島津熒光分光光度計。

1.4 統計處理

用生物機能實驗系統對原始張力進行測量分析，所有實驗數據均以表示，采用單因素方差分析和Student’s-t檢驗進行統計學分析，P＜0.05認為有統計學差異。

2 方法與結果

2.1 大鼠胸主動脈環的制備

選取雄性SD大鼠，體重180～220 g，剪頭后迅速打開胸腔取出胸主動脈，置于通以95%O2+5%CO2混合氣體的K-H液中，仔細分離血管周圍組織，清除血管內血液，剪成長2～3 mm血管環，鋼鉤固定于含K-H液的浴皿中，并通過張力換能器連于生物機能記錄儀。給予血管環2 g左右的靜息張力，平衡60 min后，重復兩次加入高K+液，預收縮血管條，檢查標本活性，然后用K-H液洗滌達基線。待動脈環穩定后，先以NE（1×10-6mol·L-1）收縮血管環，再分別用累進劑量ACh（1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol· L-1）舒張血管，若加ACh后使NE預收縮的血管舒張幅度＞80%，認為內皮完整，可繼續下一步實驗。

2.2 知母多酚對大鼠胸主動脈舒張反應的影響

取內皮完整的主動脈環，在K-H液中平衡后，分組處理：（1）正常組：繼續平衡60 min；（2）棕櫚酸損傷組：浴槽中加入棕櫚酸（100 μmol·L-1）溫育30 min；（3）知母多酚組：在加入棕櫚酸前30 min分別加入不同濃度的知母多酚 （10、100、300 μg·mL-1），觀察其對血管張力的影響；（4）水楊酸鈉組：在加入棕櫚酸前30 min加入5 mmol·L-1的水楊酸鈉。在上述各組繼續用NE（1×10-6mol·L-1）預收縮的基礎上，依次累進加入胰島素 （1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol·L-1），每次間隔20 min，記錄血管張力變化曲線，觀察胰島素誘導的舒張百分比。

如圖2所示，棕櫚酸刺激下，由胰島素調節的內皮依賴性血管舒張受到極大程度的抑制，證明造模成功。加入不同濃度知母多酚 （10、100、300 μg· mL-1）預處理后，胰島素調節的內皮依賴性血管舒張得到明顯改善，其中高劑量組與棕櫚酸損傷組比較有顯著差異（*P＜0.05）。證實了知母多酚對血管內皮的保護作用及作用的濃度呈梯度依賴性。

圖2 知母多酚對棕櫚酸損傷主動脈環舒張功能的影響正常組、水楊酸鈉組、知母多酚高劑量組與模型組相比，*P＜0.05

2.3 知母多酚對IL-6、TNF-α蛋白水平表達的影響

選用生長良好的HUVEC，以5×105mL-1接種于6孔培養板，每孔加入細胞懸液1 mL，待細胞融合后，換用無血清DMEM培養基，使細胞同步化后即進行實驗分組：（1）正常組：用10%FBS的DMEM培養基溫育HUVEC 24h；（2）棕櫚酸組：加入100μmol·L-1的棕櫚酸溫育HUVEC 24 h；（3）知母多酚組：先分別用10、100、300 μg·mL-1的知母多酚預溫育HUVEC 30 min，再加100 μmol·L-1的棕櫚酸共溫育HUVEC 24 h；（4）水楊酸鈉組：用5 mmol·L-1的水楊酸鈉預溫育HUVEC 30 min，再加入100 μmol·L-1的棕櫚酸共溫育HUVEC 24 h；無菌操作，吸取上清液，分裝，于-70℃低溫冰箱保存，ELISA試劑盒檢測。

如圖3、圖4所示，棕櫚酸刺激下，炎性細胞因子IL-6、TNF-α較空白組明顯增加，知母多酚（10、100、300 μg·mL-1）能顯著抑制內皮細胞IL-6、TNF-α的釋放。說明了知母多酚對內皮細胞的保護作用可能與抑制細胞的炎癥通路有關。

圖3 知母多酚對棕櫚酸刺激下內皮細胞IL-6釋放的影響

圖4 知母多酚對棕櫚酸刺激下內皮細胞TNF-α釋放的影響

2.4 知母多酚對體外糖基化修飾蛋白質的抑制試驗

反應液：BSA 0.5%、D-葡萄糖5 mmol、果糖5mmol、疊氮鈉0.02%，臨用前用PBS配制。將上述反應液1.9mL分裝于2.0mL的試管內，再加入不同濃度的知母多酚0.1mL（臨用前以PBS分別配制成1×10-2、8×10-3、6×10-3、4×10-3、2×10-3、1×10-3g·L-1），并將試管密封，置于37℃孵育各21天，形成糖基化修飾的白蛋白（AGE-BSA），陽性藥為鹽酸氨基胍（10、5、1mmol·L-1），另設不加任何藥物的糖基化系統、無蛋白的空白組、無糖空白組，每組設4個復孔。利用AGE-BSA在激發波長370/發射波長450 nm有特征性吸收光譜，采用熒光光譜分析法測定其形成的AGE-BSA含量（激發波長370 nm，發射波長450 nm，靈敏度2，增益5，縫寬5 μm）。結果以熒光值表示，組間采用t檢驗。

如表1所示，與模型組相比，陽性藥氨基胍鹽酸鹽（10 mmol·L-1）的抑制率達到86.88%；知母多酚（10-2g·L-1）的抑制率達到99.29%，而知母多酚（10-3g·L-1）的抑制率也達到66.45%。說明知母多酚能顯著抑制體外糖基化產物的生成。

表1 TPAA對蛋白質體外糖基化終產物（AGEs）熒光值測定結果

3 討 論

3.1 內皮細胞（VEC）是胰島素的靶器官之一

生理濃度下胰島素能增強內皮細胞內皮型NO合酶的表達，從而增加NO的釋放；亦可直接作用于血管平滑肌，使細胞膜超極化及Ca2+通道關閉，介導血管舒張。胰島素的這一生理活性對維持血管內皮的正常功能起著關鍵作用，且胰島素介導的舒張血管活性作用具有內皮依賴性[3]。游離脂肪酸可引發血管炎癥反應，促進粘附分子表達致炎性細胞因子，如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等釋放，其中TNF-α通過增加活性氧的生成促使NO失活，從而降低血管內皮依賴性舒張[4]。

本實驗中用棕櫚酸刺激大鼠胸主動脈環，胰島素介導的主動脈環舒張作用顯著下降，NO釋放減少。知母多酚和水楊酸鈉都能有效改善棕櫚酸損傷的VEC依賴性血管舒張功能和VEC內源性NO釋放。水楊酸鈉是炎癥反應的有效抑制劑，并且能顯著恢復血管舒張功能。因此提示炎癥可能參與棕櫚酸作用于血管內皮的反應。

3.2 蛋白質的非酶糖基化

蛋白質的非酶糖基化是體內的葡萄糖等酮糖與體內多種蛋白質，在高糖或氧化應激條件下發生非酶催化的糖基化作用，生成可逆的Schiff堿，繼而重排生成穩定的Amadori產物，再降解為α-酮醛復合物，生成棕褐色具有熒光性的糖基化終末產物（AGEs）[5]。AGEs在組織中形成和沉積后，引起組織的老化和功能衰退，在眼晶狀體表現為白內障；血管基底膜的糖基化則與糖尿病微血管病變等有關。低密度脂蛋白的糖基化修飾與高血脂癥、糖尿病心血管并發癥有密切關系。在糖尿病患者，糖基化的速度與正常人相比大大加快，與糖尿病微血管并發癥密切相關。

本實驗結果發現，知母多酚用藥組糖化蛋白明顯減少，提示其可能對體外的非酶糖基化反應具有抑制作用。

[1] Miura T,Ichiki H,Iwamoto N,et al.Antidiabetic activity of the rhizoma of Anemarrhena asphodeloides and active components,mangiferin and its glucoside[J].Biol Pharm Bull,2001,24(9):1009-11.

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[3] Steinberg HO,Chaker H,Leaming R,et al.Obesity/insulin resistance is associated with endothelial dysfunction.Implications for the syndrome of insulin resistance [J].J Clin Invest,1996,97(11):2601-10.

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[5] Yamagishi S.Role of advanced glycation end products (AGEs)and receptor for AGEs(RAGE)in vascular damage in diabetes[J].Exp Gerontol,2011,46(4):217-24.