人類早期應激獼猴模型新進展

馮曉麗 胡新天

①助理研究員，②研究員，中國科學院昆明動物研究所，昆明 650223

母嬰分離常常被用來模擬人類早期應激，但它對個體的負面影響能否被長期正常的生活經歷所逆轉仍然未知。本研究考察了母嬰分離獼猴經歷了長期的正常社會生活之后的HPA軸功能和行為。結果發現，母嬰分離猴的HPA軸功能紊亂，行為異常，尤其是反映焦慮狀態的行為大大增加。從而第一次在獼猴中證明，母嬰分離的影響是長期和持久的。同時也說明母嬰分離獼猴是人類早期應激的理想動物模型，可以用來研究早期應激誘發的某些精神疾病的發生和發展。

1 什么是應激

一個月黑風高的夜晚，由于加班晚歸的你走在一條行人稀少的小巷里，突然，你覺察到身后有個黑影在向你靠近，眼看就要追上來了。這時，你的心跳開始加速，手心開始出汗，呼吸變得急促，心神越來越不定。你自己在心里盤算，萬一有什么狀況發生，那么三十六計走為上策，但是，若實在逃不脫怎么辦？只有一搏。不知不覺你已經轉到了燈火通明的大道上，而身后的黑影也超過你，走在了你的前面。此時你才松了口氣，發覺原來只是一場虛驚。以上生理變化便是典型的應激反應，這些變化的最終目標只有一個，那就是激活自我保護的防御機制，動員你體內的能量，讓你在面臨威脅時，做好充分的準備奮力反抗或者迅速逃跑，這也是應激的生物學意義所在。

哺乳動物的應激反應主要涉及到下丘腦－垂體－腎上腺皮 質 軸（hypothalamic－pituitary－adrenal軸，即 HPA軸）各部件的協同作用［1］。其中，下丘腦位于丘腦的下方，與中樞神經系統的其他部位有密切的相互聯系。腺垂體位于顱內底部，與下丘腦相連，其分泌的激素直接或間接調節外周靶器官的生理功能。腎上腺皮質就是垂體作用的重要靶器官之一。機體發生應激反應時，下丘腦的一類細胞分泌一種激素，稱作促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH），CRH經血流向下運輸，到達腺垂體，與腺垂體細胞表面的特異性受體結合，受體被激活后，使得垂體細胞分泌促腎上腺皮質激素（ACTH）。ACTH通過血液循環被運送到腎上腺皮質，結合并激活相應受體，促使可的松的分泌。

可見，可的松是HPA軸的最終產物，它能夠在應激性條件下從腎上腺皮質釋放［2－3］。在應激持續時間較短（急性應激）的情況下，暫時增加的可的松含量幫助機體盡可能地加強對肌肉、心臟和大腦的能量供應，使機體做好逃跑或搏斗的準備。當然，機體為了保持穩定的狀態，可的松的大量分泌必須及時終止。下丘腦和垂體腦區內存在可的松的受體，在正常機體中，可的松大量分泌后，通過血液的運輸與這些受體結合，啟動HPA軸內部的負反饋抑制，從而減少CRH的分泌，最終使可的松的濃度維持在一穩定水平上。同時，ACTH的受體也存在于下丘腦CRH神經元，起負反饋的作用，抑制CRH的過量分泌［4］。這些過程構成了HPA軸自身的負反饋機制。

類似的負反饋機制同樣存在于大腦其他腦區。海馬腦區中分布了大量的可的松受體，應激反應當中產生的大量可的松可以與之結合，激活受體，使海馬對下丘腦室旁核神經元的抑制性輸出起作用，從而減少ACTH和可的松的分泌［5－6］。

2 慢性應激的危害

急性應激可以使機體更好地對抗外界刺激，提高機體耐受性。然而，由慢性應激（一般認為持續時間超過一周的應激）引起的可的松水平居高不下則會導致特定腦區，如海馬的嚴重損傷［7－9］。在慢性應激過程中，持續產生的可的松會與海馬腦區中大量的受體結合，直接刺激海馬，使其發生結構和功能的改變。例如，持續的應激能夠導致海馬區椎體細胞的萎縮，最終導致海馬體積減小，損害個體的認知功能。同時，由于應激調節關鍵部位杏仁核通過間接的神經投射與前額葉皮層的聯系密切，所以在持續暴露于慢性應激的條件下，負責腦內許多高級認知功能處理的前額葉皮層也會受到損害［10］。

在現代社會中，慢性應激可以有很多種表現形式。其中被研究者廣泛關注的一種形式就是童年的不幸經歷，又稱為早期應激。童年時期被虐待、父母離異、父母其中一方患有精神疾病、家庭不和等不幸事件，對個體的成長產生的深遠負面影響往往超乎人們的意料。例如，研究者發現，如果童年有過不幸經歷，那么成年后濫用藥物、患精神疾病（例如抑郁癥）的風險則大大提高，更加可能表現出暴力傾向。如此看來，有關童年不幸經歷的研究對個體乃至整個社會的意義重大。當然，最直接的方式就是在人類當中進行童年不幸經歷影響的研究。一般有3種研究方式：前瞻式、回顧式以及自我報告問卷調查。前瞻式就是研究者先將研究對象選定，然后做追蹤研究，這種方式耗時相當長，而且由于變量一旦設定就不能夠更改，顯得不夠靈活；回顧式則是以研究者現在為結果，回顧過去，如果采用此種研究方式，那么被研究者可能對過去不幸經歷的刻意忘記或記憶扭曲使得研究結果不夠可靠；自我報告則是基于自己主觀的理解來填寫問卷，這種方法同樣會影響結果的客觀性。簡言之，人類研究中難以控制的影響因素太多以及重要試驗操作無法在人類身上實現。所以，越來越多的研究者把目光集中于相關動物模型。獼猴在系統發生上和人類很接近［11］；它們的腦結構和人類相似［12］；同時還具備行為方面與人類的相似性，例如對社會關系的依賴性，相似的應激反應，復雜的認知能力，情緒表達的范圍［13］，所以獼猴在早期應激相關研究中是理想的動物模型。

3 動物模型的母嬰分離研究

在動物模型當中，早期的母嬰分離常常被用來模擬人類童年的不幸經歷。母嬰分離對個體的影響通常集中于行為和HPA軸兩方面的研究。在行為方面，母嬰分離導致活動量和社交行為減少［14］、以及表現異常的攻擊行為、自我傷害行為［15］等等。關于母嬰分離對HPA軸的影響，又分為基礎功能和急性應激反應的改變。母嬰分離如何影響個體HPA軸基礎功能的改變，不同的研究得到的結果并不一致，沒有定論。我們分析，這可能與不同研究中采用的不同研究方法有關。衡量HPA軸基礎功能的途徑之一是測定可的松的水平，如果測定的是血樣、唾液或尿樣中的可的松含量，那么采樣的時間以及采樣之前對動物進行抓捕或環境中其他刺激因素都可能對可的松水平產生較大的影響，從而混淆實驗結果［16－19］。毛發可的松的水平代表的是過去3～6個月當中可的松分泌的累積量，不會受節律或其他急性應激因素的影響［20］。所以，相比血液或其他采樣方法，毛發分析對于研究母嬰分離對基線可的松水平的長期影響更為可靠。正是因為如此，本研究中采用了毛發分析的方法。

在急性應激方面，一些研究將小猴分別隔離30min，1 h，2.5 h以后，都發現母嬰分離組的可的松水平比對照組更低［21－23］。雖然研究結果比較一致，但是從以上研究可以看出，目前對應激狀態下獼猴可的松分泌變化的研究中多數將個體進行短時分離，對此，存在一定的爭議。因為在將動物隔離時，通常母嬰分離組個體是與同伴短時分離，對照組（母猴飼養組）個體是與母猴分離，而且之前從未與母親分離過。換言之，短時分離對于母嬰分離組和母猴飼養組的刺激強度是不同的。相應地，第一次與母猴分離的母猴飼養組小猴的應激反應應該更加強烈，實際上這也與上述研究結果一致。所以，為了使母嬰分離組和對照組的個體經歷同樣強度的刺激，然后在此基礎上進行急性應激變化規律的測定，本研究將抓捕而不是隔離作為刺激因素，抓捕人員進入群體內的時間點作為刺激開始的時間。

4 研究的立論依據

在證實母嬰分離猴HPA軸功能異常的研究中，檢測要么是在母嬰分離后馬上進行，要么是采樣和分離結束的時間間隔很短。所以，我們提出了問題，究竟母嬰分離造成的影響能否為分離結束之后的正常社會生活經驗所逆轉？因為有研究者認為，在分離結束不久后獲得的檢測指標只能反映飼養環境對動物行為的立即影響，而并非其自身穩定的特點［24］。同時，在人類當中，患上與早期應激有關的精神疾病的個體在發病前通常已經歷過相當長時間的正常社會生活。大鼠研究結果則發現，母嬰分離造成的對HPA軸的影響能夠被抵消甚至逆轉［25－26］，這就使得回答我們提出的問題更加迫切。為了回答這個問題，我們進行了長期的實驗研究，以確定在非人靈長類當中，母嬰分離的影響能否被分離結束之后的長期正常社會生活所逆轉。

5 實驗方法

實驗動物采用恒河猴（Macaca mulatta），分別選自兩種飼養條件：母猴飼養組（mother reared，MR，即對照組）和同伴飼養組（peer reared，PR，即母嬰分離組）。PR組的猴子是從剛出生后就和母親分開的。在小猴長到6～7個月大的時候，兩組的猴子被隨機放到不同小社會群體中，開始正常的社會生活。每個小社會群體由10只左右的同齡小猴（包括雌性和雄性）組成。

在以往研究結果的基礎之上，我們分別考察了母嬰分離對小猴行為、基礎HPA軸功能和急性應激反應隨時間變化的規律這三個方面的影響。需要說明的是，本研究在小猴長到2歲和3.5歲的時候進行檢測，即分別是在母嬰分離結束后又經過1年半和3年的時間，也就是說檢測的是母嬰分離的長期影響，這點與以往研究有所不同。

行為的記錄是在小猴適應觀察人員以后，對其進行跟蹤錄像完成的。本研究分析了猴子自主活動行為、刻板行為和挨近坐著的行為。自主活動行為包括走、爬、跑、跳［27］。刻板行為是指重復性的、無明確指向或目標的行為。刻板行為形式多樣，主要包括以下幾種：來回踱步（重復性，儀式化的運動，通常是繞著籠子來回走）；吮吸手指或腳趾；緊緊抓住自己身體的某一部位；身體來回搖晃（雙腳不動，上半身前后運動）；用四肢彈跳（用四條腿跳上跳下）［2830］。由錄像目標猴發起的挨近坐著（在其他猴子一臂距離之內）的行為用于衡量社會交往。

基礎HPA軸功能則是通過毛發的可的松水平來衡量。采集到的毛發通過清洗、烘干、磨碎、定量稱取、萃取的處理，得到含有可的松的溶液。最后由專業醫生通過放射性免疫試劑盒分析其中可的松的含量。

作為背景，首先來了解一下放射性免疫法測定可的松含量的原理。可的松的結合蛋白通常是白蛋白，二者結合后作為放射性免疫試劑盒中的標記抗原，與待檢測樣本中的非標記抗原競爭結合試劑盒中特異性抗體。在試劑盒中，作為試劑的標記抗原和特異性抗體的量是一定的，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此二者互相競爭結合特異性抗體。由于標記抗原及特異性抗體的量是一定的，故標記抗原特異性抗體復合物的量就隨著待檢測樣本中非標記抗原的量而改變。若非標記抗原量增加，相應地則會結合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結合，使標記抗原特異性抗體復合物的量減少，游離的標記抗原量就相應增加。換句話說，標記抗原特異性抗體復合物的放射性強度與待檢測樣本中（非標記）抗原的濃度成反比。如果將標記抗原特異性抗體復合物與游離的標記抗原分開，分別測定其放射性強度，則可計算結合態的標記抗原與游離態標記抗原的比值，此比值與待檢測樣本中的抗原量呈函數關系。根據一系列不同劑量的標記抗原的反應，可繪出一條劑量反應曲線，即隨著作為試劑的標記抗原濃度的不同，上述比值的變化曲線，則可以在劑量反應曲線上查出樣本中抗原（可的松）的含量。

為了確定抓捕刺激呈現后，母嬰分離猴可的松水平隨時間變化的規律，本研究還進行了血樣采集。分別于抓捕人員入籠8 min，10～15 min，20～30min之內從每只猴子身上采到的3份血樣共同用于判斷小猴在面對急性抓捕刺激時血液可的松分泌水平的變化規律。

6 實驗結果

6.1 母嬰分離猴行為的異常表現

結果發現，與MR組相比，PR組的自主活動時間極顯著減少，自主活動頻率極顯著降低。同時，在PR組猴子身上可以觀察到幾乎所有種類的刻板行為（主要是來回踱步、吮吸手指或腳趾和抓握自己身體的某一部位），有時其中一只身上就會表現出3～4種不同的刻板行為，而且每次刻板行為的持續時間都很長。對于 MR組，只在少數幾只猴子身上觀察到刻板行為，每只猴子最多只表現1～2種刻板行為，而且通常即使表現刻板行為，持續時間也很短。本研究中PR組猴子長時間的刻板行為可能反映了其高度焦慮的狀態，因為刻板行為的功能之一便是緩解焦慮。猴子的挨近行為被認為是一種防御性機制，目的是為了取暖或者遇到威脅時，通過察覺被挨近猴子的反應保持自己的警覺性。本研究中發現，PR組猴子主動挨近行為減少，可能涉及到與早期母嬰分離相關的社會反應持續性的改變。

6.2 母嬰分離猴HPA軸功能異常

早期飼養環境會顯著影響基線可的松水平。與MR組（對照組）相比，PR組的毛發可的松水平顯著降低。造成這種后果的原因之一可能是持續暴露于出生后的早期應激會誘發HPA軸的某個部件發揮的功能下調，從而使可的松水平降低。

當然，也有可能是由于持續的早期應激（母嬰分離）引起HPA軸調控回路當中的負反饋抑制增強，最終使可的松分泌減少。還有可能是雖然早期的慢性應激會誘發下丘腦室旁核和垂體的過度活動，但是在外周，腎上腺已產生適應，其反應性降低。

另一方面，PR組和MR組在面對同樣急性刺激的情況下，可的松分泌隨時間變化的規律表現出顯著差異。刺激誘發的可的松分泌水平在PR組和MR組都有所增加，但是PR組出現峰值的時間點比MR組大大延遲。具體地講，在抓捕人員入籠10～15 min時，MR組猴子血液可的松水平就快速升高，而PR組的可的松水平的升高卻緩慢得多。相反，抓捕人員入籠20～30min的時候，血液可的松水平又急速下降，說明此時MR組猴子對抓捕人員入籠這一刺激已經適應。在此期間，對于PR組的猴子，它們的可的松水平仍然在緩慢上升，說明它們并沒有很好地適應外界的刺激。事實上，在抓捕刺激呈現片刻之后，MR組的血液可的松分泌量就快速增加。這種適應性的策略可以幫助動物快速應對外界威脅，使其在面對不妙情形時做好逃跑的準備。之后，由可的松受體介導的負反饋控制作用又可以保護HPA軸不會被過度激活，使應激反應快速、及時地終止。MR組個體身上有效的負反饋機制能夠使可的松水平快速回到基線值。相反地，在抓捕刺激呈現后，PR組的可的松分泌峰值出現的時間顯著延遲，說明PR組個體的急性應激反應比MR組個體慢得多，PR組獼猴并不能像MR組獼猴那樣有效地應對外界環境的刺激。

可見，除了基線可的松水平和急性應激源誘發的可的松分泌模式的改變，PR組個體在行為模式上也表現出長期的變化，同時這種變化不能為早期分離結束之后正常的社會生活所逆轉。事實上，關于人類的研究也得到過類似的結果。有研究證明，童年時期受過虐待的人群在成年后的行為表現依然異常［31］。

母嬰分離在行為上對獼猴造成的不可逆的影響為可的松數據提供了一種補充，使我們更加容易理解PR組和MR組之間的基線可的松水平和應激誘發的可的松分泌模式的不同。

應激系統功能的紊亂常常和神經生物學的改變相關聯，而后者又可以用行為衡量。本研究中在母嬰分離猴子身上發現的行為異常，尤其是高強度高頻率的刻板行為，可能與HPA軸的功能紊亂有關。事實上，HPA軸系統的紊亂會影響中樞神經遞質系統［32］，例如5羥色胺系統，而后者又和刻板行為表達出來的焦慮相關［33］。

7 結語

研究結果說明，母嬰分離獼猴即使在分離結束后，再經歷很長一段時間的正常社會生活，此時它們的行為模式和HPA軸功能仍然異常，說明這種異常的行為是長期性的改變。事實上，人類的研究已經證明，嬰幼兒或童年時期缺乏父母的關愛會給個體帶來長期的負面影響［31］。這說明，和嚙齒類動物模型相比，母嬰分離的恒河猴是研究人類早期逆境的理想動物模型，并且對于探究早期應激誘發的精神疾病的發生發展過程和治療策略的尋找更具優勢。

（2011年11月14日收到）

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