用RP－HPLC法測定靶控輸注下血漿中的丙泊酚濃度

夏 雨，魏 威，李 任，史麗敏，劉韶華，田 鳴

（1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院西藥劑科，北京100050；2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院麻醉科，北京100050）

丙泊酚作為全身靜脈麻醉藥在臨床廣泛用于麻醉誘導及維持。靶控輸注（target－controlled infusion，TCI）是指在輸注靜脈麻醉藥時，以藥動學和藥效學原理為基礎，通過調節血漿藥物濃度來控制或維持適當的麻醉濃度，以滿足臨床麻醉的一種靜脈給藥方法［1］。近年來，TCI在國內外已逐步代替間斷注射或持續輸注，成為最具應用前景的丙泊酚靜脈麻醉方式［2，3］。雖然TCI給藥時可顯示計算血漿濃度（calculated plasma concentration，Ccp）和效應室濃度（effect－site concentration，Ce）等信息，作為麻醉深度的判斷指標，但是由于目前選用的參數模型多為國外大規模群體藥動學模型，與中國人的藥動學不匹配［4，5］，從而導致Ccp與實測血藥濃度（measured plasma concentration，Cmp）之間存在差異［6］。丙泊酚的藥動學特點是靶控輸注給藥方式的主要理論基礎，而建立一種條件適合、準確、簡便、穩定的丙泊酚血藥濃度測定方法則是群體藥動學研究的基礎。目前，測定丙泊酚的血漿濃度多采用氣相色譜、HPLC法和氣－質聯用等方法，方法復雜且未結合臨床研究條件。本研究建立了操作更為快速、簡便的RP－HPLC法檢測丙泊酚的血藥濃度，并以臨床小樣本數據對方法進行驗證，以期為丙泊酚在中國人的群體藥動學研究奠定基礎。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1100型HPLC儀（包括真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器、惠普1100色譜工作站及自動進樣裝置（美國Agilent公司）；Shim－pack CLC ODS－C18色譜柱（150mm× 6.0mm，5μm，日本島津公司）；MS2型渦旋混合器（德國IKA公司）；2－5型離心機（德國Sigma公司）。

1.2 藥品和試劑 丙泊酚對照品（純度100.0%，1g／ml，英國AstraZeneca公司惠贈，批號L－22270－906－049）；內標：百里酚（thymol，分析純，中國食品藥品檢定研究院，批號100508－200301）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；水為純凈水（首都醫科大學附屬北京友誼醫院藥檢室自制）；空白血漿（首都醫科大學附屬北京友誼醫院血液科提供）。

2 方法和結果

2.1 溶液的配制 （1）內標工作液：精密稱取百里酚25mg溶于50ml甲醇，配成濃度為0.5mg／ml的儲備液，保存于4℃冰箱備用。工作時，將該儲備液用適量甲醇溶解，稀釋成濃度為10μg／ml的內標工作液。（2）血漿樣品溶液：精密吸取200μl自然解凍后的人血漿，置于5ml帶蓋的試管中，加入甲醇20μl，混勻，精密加入10μg／ml的內標工作液600μl，再次混勻后，以603.7×g離心10min，取上清液即為血漿樣品溶液。（3）對照品溶液：精密吸取1ml丙泊酚對照品溶液，用甲醇稀釋到100ml，再取0.5ml稀釋到50ml，得到濃度為100.0μg／ml的對照品儲備液。精密量取該儲備液適量，用甲醇稀釋，配成系列濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg／ml的丙泊酚對照品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Shim－pack CLC ODS－C18柱（150mm×6.0mm，5μm）；流動相：乙腈∶水＝65∶35，流速：1.5ml／min；檢測波長：220nm；柱溫：25℃：進樣量：100μl。在此色譜條件下，取空白血漿、含內標工作液的空白血漿、含內標工作液和丙泊酚對照品的空白血漿以及血漿樣品分別進樣測定，得到色譜圖見圖1。由圖1可見，血漿中內源性物質和臨床可能的合并用藥不干擾主藥的測定，內標與丙泊酚完全分離且峰形良好，丙泊酚和內標百里酚的保留時間分別約為7.5和4.7min。

圖1 丙泊酚的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of propofol

2.3 標準曲線的制備 精密量取空白血漿180μl放入5ml帶蓋試管中，加入不同濃度的丙泊酚對照品溶液20μl，得到丙泊酚系列濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／ml的血漿樣品，混勻，精密加入內標工作液600μl，再次混勻，以603.7×g離心10min，，取上清液作HPLC分析。將丙泊酚與內標的峰面積之比（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得到標準曲線方程：Y＝11.329 X－0.051 5（r＝0.999 8），線性范圍為0.05～5.0μg／ml，最低檢測濃度為0.05μg／ml（S／N≥3）。

2.4 回收率和精密度實驗 取空白血漿加入適量丙泊酚對照品儲備液，配制成低、中、高濃度分別為0.5、2.0、5.0μg／ml的血漿樣品，按2.1項下方法（2）處理，得到血漿樣品溶液。在同1d內進樣5次，計算丙泊酚的回收率和日內精密度；在第1、3、5天各測定1次，計算日間精密度，結果見表1。

2.5 穩定性實驗 取2.4項下丙泊酚低、中、高濃度分別為0.5、2.0、5.0μg／ml的血漿樣品，在配置后4℃條件下保存1、15、30d，測定濃度并計算RSD。結果低、中、高濃度丙泊芬的RSD分別為3.84%、7.74%和2.73%（n＝5）。由此可見，丙泊酚血漿樣品在配置后儲存30d無明顯變化，穩定性良好。

2.6 靶控輸注下測定丙泊酚的血漿濃度

表1 丙泊酚的回收率和精密度實驗結果Table 1 Results of recovery and precision tests of propofol（n＝5，±s，%）

表1 丙泊酚的回收率和精密度實驗結果Table 1 Results of recovery and precision tests of propofol（n＝5，±s，%）

（ρB／μg·ml－1） 日內RSD濃度 日間RSD 回收率0.5 2.38 5.93 103.0±2.5 2.0 1.42 5.12 98.0±1.4 5.0 3.07 4.54 102.5±3.1

2.6.1 臨床資料和麻醉方案 選擇5例行全身麻醉的病人，男性3例，女性2例，年齡32～71歲，均符合美國麻醉醫師協會病情估計分級I～III級，無全身麻醉禁忌，手術時間2～4h，無明確的精神疾病、藥物濫用及酗酒史，術中無大出血。所有病人均通過肘正中靜脈在30min內輸入乳酸鈉林格液，劑量為10ml／kg，之后采用“Diprifusor”TCI系統（由英國AstraZeneca公司“得普利麻”預充注射器、Diprifusor識別軟件、靶控輸注軟件，以及英國Grasby公司3500注射泵組成），選擇內置的TCI模式，輸入病人的年齡和體重，以靶控血漿濃度（target－controlled plasma concentration，Ctp）3.5μg／ml輸注丙泊酚，同時以Ctp 4.0ng／ml輸注瑞芬太尼，給予羅庫溴銨，劑量為0.9mg／kg，2min后行氣管內插管，待丙泊酚Ccp達到3.5μg／ml并持續30min后，將Ctp下調為3.0μg／ml，間斷給予羅庫溴銨維持肌松。待丙泊酚Ccp達到3.0μg／ml并持續30min后，再將Ctp下調為2.5μg／ml。手術結束前停用丙泊酚和瑞芬太尼，靜脈給予芬太尼0.1mg。

2.6.2 血樣采集 在丙泊酚Ccp分別達到3.5、3.0、2.5μg／ml并持續30min時，抽取橈動脈血各3ml，注入含肝素的試管內，以603.7×g離心10min，分離血漿，保存于4℃冰箱備用。測定時，將血漿按2.1項下方法（2）操作，制備血漿樣品溶液，測定丙泊酚的濃度，結果5例病人在上述3個時間點的血藥濃度平均值分別為（3.48±0.19）、（2.99±0.12）和（2.48±0.17）μg／ml，與靶控輸注泵上顯示的Ccp比較，相對標準偏差分別為5.49%、3.96%和6.97%。

3 討 論

丙泊酚的化學結構中具有苯酚母核，有較強的紫外吸收和熒光吸收。本研究的HPLC法采用紫外檢測器，雖然靈敏度較熒光檢測器低，但最低檢測限低至0.05μg／ml。對于臨床麻醉監測，TCI麻醉誘導期丙泊酚的血漿濃度在3min左右就達到3.5μg／ml，麻醉誘導及蘇醒期血藥濃度大多維持在1～5μg／ml，因此紫外檢測法可以滿足測定要求。

本研究采用沉淀法進行血漿樣品處理，比萃取法更簡單、快速，適用于臨床大樣本血藥濃度監測。在沉淀劑的選擇上，經過對比實驗，發現用乙腈時在內標峰處有雜質峰干擾，而用3倍體積的甲醇沉淀血漿蛋白質完全，無需添加三氯乙酸或硫酸銨等蛋白質沉淀劑，亦無干擾峰出現，因此采用在血樣中直接加入內標物的甲醇溶液來沉淀蛋白質，再次簡化了預處理過程。本研究僅用乙腈和水組成流動相，即可得到良好的色譜峰峰形和合適的出峰時間，流動相體系簡單，易于重復。本研究考察了血漿中的其他藥物成分，即5例病人手術前與手術中與丙泊酚合并使用的藥物，如苯巴比妥、多巴胺、瑞芬太尼、羅庫溴銨、利多卡因、腎上腺素、甘露醇、地塞米松、肝素鈉和魚精蛋白等對主藥峰的影響，結果發現其他藥物并不干擾內標和丙泊酚的測定，不會造成主藥不出峰或出峰時間延遲，表明該法專屬性較好，可以用于靶控輸注下丙泊酚血漿濃度的測定。

采用靶控輸注丙泊酚，在其Ccp達到Ctp時再繼續平衡30min，此時丙泊酚的血漿濃度已達到相對穩態，個體間藥動學差異被降至最小，采集血樣并測定Cmp，與靶控輸注泵上顯示的Ccp進行比較，差距為3.96%～6.97%，表明本法可以準確測量丙泊酚的血漿藥物濃度。本方法簡便、快速、準確、重現性好，可以滿足丙泊酚臨床藥動學研究的需要。

［1］ Glen J B.The development of‘Diprifusor’：a TCI system for propofol［J］.Anaesthesia，1998，53（Suppl 1）：13－21.

［2］ Raeder J.Opioid or propofol：what kind of drug for what kind of sedation？Manual dosing or target－controlled infusion？［J］.Anesth Analg，2009，108（3）：704－706.

［3］ Viviand X，Léone M.Induction and maintenance of intravenous anaesthesia using target－controlled infusion systems［J］.Best Pract Res Clin Anaesthesiol，2001，15（1）：19－33.

［4］ 葉紅波，鄭 宏，張興安，等.多中心異丙酚群體藥物動力學評價［J］.藥學學報，2010，45（12）：1550－1558.

Ye HongBo，Zheng Hong，Zhang XingAn，et al.Population pharmacokinetic modeling and evaluation of propofol from multiple centers［J］.Acta Pharm Sin，2010，45（12）：1550－1558.In Chinese with English abstract.

［5］ 林彥俊，李 羽，劉 斌.國人群體異丙酚藥代動力學參數靶控輸注系統的功能評價［J］.四川大學學報（醫學版），2006，37（5）：814－815.

Lin YanJun，Li Yu，Liu Bin.Function evaluation of targetcontrolled infusion system in population pharmacokinetics of propofol in Chinese［J］.J Sichuan Univ（Med Sci），2006，37（5）：814－815.In Chinese with English abstract.

［6］ 張馬忠，吳 健，王珊娟，等.靶控輸注異丙酚的臨床應用和準確性評價［J］.中華麻醉學雜志，2002，22（11）：660－663.

Zhang MaZhong，Wu Jian，Wang ShanJuan，et al.The accuracy of target－controlled infusion of propofol in Chinese［J］.Chin J Anesthesiol，2002，22（11）：660－663.In Chinese with English abstract.