用HPLC－MS／MS法同時測定Caco－2細胞單層轉運介質中嗎替麥考酚酯和麥考酚酸的濃度

余自成，江 濤，瞿江媛，田薇薇，馬明華，陳紅君，陳紅專

（1.上海市楊浦區中心醫院臨床藥學和藥理學研究室，上海200090；2.上海交通大學醫學院藥理學教研室，上海200025）

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一種重要的免疫抑制藥物，已獲準用于預防腎臟、肝臟和心臟移植器官排異反應，作為免疫抑制首選藥物在臨床廣泛應用［1］。MMF為前體藥物，口服給藥后轉變為活性產物麥考酚酸（mycophenolic acid，MPA），發揮免疫抑制作用。本研究建立了HPLC－MS／MS法同時測定轉運介質中MMF和 MPA的濃度，用于研究MMF和MPA穿透Caco－2細胞單層的跨膜轉運機制，評價P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）在兩者腸道吸收轉運中的作用。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型HPLC儀，包括Quat Pump G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、G1314B可變波長紫外檢測器、G1322A在線真空脫氣機和G1316A柱溫箱；6410三重串聯四極桿LC／MS儀和Mass Hunter工作站軟件（美國Agilent公司）；BS224S型精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Delta 320型pH計（梅特勒－托利多儀器有限公司）；XW－80A旋渦混合器（原上海醫科大學儀器廠）；M型移液器（法國Gilson儀器有限公司）；Milli－Q超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥品和試劑 嗎替麥考酚酯對照品（純度99.0%，德國羅氏診斷有限公司）；麥考酚酸對照品（純度99.8%，羅氏生物科技公司）；吲哚美辛對照品（純度99.2%美國Sigma－Aldrich公司）；D－葡萄糖（英國Biotech Bio Basic公司）；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，高純度，上海生工生物工程有限公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（上海交通大學醫學院自制）。

2 方法和結果

2.1 溶液的配制 （1）MMF儲備液：精密稱取MMF對照品9.4mg，加二甲亞砜（DMSO）216.8μl溶解，混勻，即得濃度為100mmol／L的MMF對照品儲備液。（2）MPA儲備液：精密稱取MPA對照品6.8mg，加DMSO 212μl溶解，混勻，即得濃度為100mmol／L的MPA對照品儲備液。（3）Hank平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）：精密稱取CaCl2140mg、KCl 400mg、KH2PO460mg、MgCl2·6H2O 100mg、NaCl 8g、Na2HPO4、MgSO4·7H2O 100mg、NaHCO3350mg、48mg、D－葡萄糖4.5g和HEPES 5.95g，加超純水溶解并稀釋至1 000ml，用1mol／L的NaOH溶液調節pH至7.4，經0.22μm微孔濾膜過濾，分裝，置于4℃冰箱儲存備用。（4）吲哚美辛（內標）儲備液：精密稱取吲哚美辛對照品3.0mg，加DMSO 1.0ml溶解，搖勻，即得濃度為3mg／ml的吲哚美辛儲備液。精密移取吲哚美辛儲備液50μl，加HBSS溶液稀釋至5ml，搖勻，即得30μg／ml的吲哚美辛對照品溶液。（5）樣品溶液：取轉運介質樣品0.1ml，置于1.5ml塑料離心管中，加入內標溶液（30μg／ml）5μl，渦旋振蕩30s，混勻，吸取上清液作為樣品溶液。上述溶液均置－40℃低溫冰箱中儲存備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB－C18柱（50mm×2.1mm，3.5μm）；流動相：A相（甲醇，含0.05%甲酸），B相（水，含0.05%甲酸）；梯度洗脫：0～3.60min，40%A，流速：0.3ml／min，3.61～7.00min，65%A，流速：0.6ml／min，7.01～10.00min，40%A，流速：0.6ml／min；柱溫：30℃。2.3 質譜檢測條件 采用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度100℃，毛細管電壓4.0kV，去溶劑氣溫度350℃，去溶劑氣流速9.0L／min，碰撞氣為N2，霧化氣壓力206.9kPa，離子駐留時間均為200ms。檢測方式為多種反應監測（MRM），用于定量分析監測的離子反應為MMF：m／z 433.8→194.8，離子極性為正離子，錐孔電壓150V，碰撞能量35eV；MPA：m／z319.1→191.0，離子極性為負離子，錐孔電壓165V，碰撞能量30eV；吲哚美辛：m／z 356.0→312.1，離子極性為負離子，錐孔電壓80V，碰撞能量5eV。

2.4 色譜－質譜行為 在2.2項色譜條件和2.3項質譜條件下，取HBSS溶液，添加MMF對照品、MPA對照品和吲哚美辛對照品的HBSS溶液，以及樣品溶液分別進樣，在各自的離子通道上采集數據。結果MMF、MPA和內標物的保留時間分別為4.16、6.38和8.49min，色譜峰形較好，能夠完全分離，色譜圖見圖1。

圖1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸的HPLC－MS／MS譜圖Figure 1 HPLC－MS／MS photograms of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid

2.5 方法學驗證

2.5.1 離子抑制實驗 將MMF和MPA分別用甲醇、流動相和HBSS溶液溶解后進樣測定，考察離子化過程中由HBSS溶液殘留介質效應產生的離子抑制作用。結果發現，不同溶劑對MPA的質譜檢測信號影響相似，用甲醇和流動相溶解質譜檢測信號強度相同，用HBSS溶液溶解較甲醇和流動相溶解質譜檢測信號強度略有下降，但差別不明顯，而將HBSS溶液中鹽份切換與不切換至廢液的質譜檢測信號強度相同。但溶劑不同對MMF的質譜檢測信號影響差異較大，信號強度由大到小依次為：流動相＞甲醇＞HBSS溶液。用流動相溶解，質譜檢測信號約為用HBSS溶液溶解時的兩倍，而將HBSS溶液中鹽份切換至廢液可以提高檢測信號強度。

2.5.2 標準曲線的制備和最低檢測濃度 用空白HBSS溶液將MMF和MPA對照品儲備液稀釋，分別配制成系列濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00μmol／L的溶液，按照樣品測定方法操作，以內標法定量。以MMF、MPA與內標物峰面積之比（As／Ai）為縱坐標，濃度（c）為橫坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線方程。MMF和MPA在0.01～20μmol／L范圍內有良好線性關系，MMF的標準曲線方程為：As／Ai＝－0.035 2＋0.394 5 c（r＝0.999 1），MPA為As／Ai＝0.005 5＋0.050 8 c（r＝0.999 5）。以信噪比（S／N）≥3為標準，測得MMF和MPA的最低檢測濃度分別為0.005、0.001μmol／L。

2.5.3 精密度和回收率實驗 用適量空白HBSS溶液將MMF和MPA對照品儲備液稀釋，配成濃度為0.10、1.50和15.00μmol／L的對照品質控樣品，按照2.2項下色譜條件和2.3項下質譜條件，在同一天重復測定5份，計算日內RSD。每天測定1份，連續測定5d，計算日間RSD。利用標準曲線方程計算濃度，以測得濃度與配制濃度的比值計算方法回收率。結果表明，MMF的日內RSD＜6.02%，日間RSD＜7.27%；3種濃度的回收率分別為（103.2±7.5）%、（97.3±3.1）%和（96.0±3.4）。MPA的日內RSD＜8.85%，日間RSD＜9.25%；3種濃度的回收率分別為（106.9±1.0）%、（106.0± 5.7）%和（108.4±3.2）（n＝5）。

2.5.4 穩定性實驗 將MMF和MPA標準質控樣品于室溫（20℃）放置48h、37℃培養箱放置4h、4℃冰箱放置1周，以及－20℃冰箱放置3個月，測定濃度，評價樣品穩定性，結果見表1。

表1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸穩定性實驗結果Table 1 Results of stability tests of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid（n＝3，±s，cB／μmol·L－1）

表1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸穩定性實驗結果Table 1 Results of stability tests of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid（n＝3，±s，cB／μmol·L－1）

個月嗎替麥考酚酯濃度 20℃放置48h 37℃放置4h 4℃放置1周－20℃放置3 1.50 1.49±0.01 1.45±0.01 1.43±0.01 1.45±0.05 15.00 14.76±0.40 14.82±0.77 14.30±0.15 14.25±0.34麥考酚酸1.50 1.49±0.02 1.48±0.05 1.46±0.06 1.45±0.03 15.00 15.33±0.46 14.68±0.09 14.22±0.33 14.60±0.45

3 討 論

對Caco－2細胞單層轉運實驗樣品的分析通常采用HPLC法［2，3］，但是這些檢測器靈敏度較低，特別是紫外檢測器對多數化合物的檢測靈敏度均不夠。MS法作為一種新的檢測技術，在藥物代謝研究中正發揮著越來越重要的作用，特別是HPLC－MS／MS法因具有更好的專屬性和靈敏度而被公認為是目前用于生物樣品定性和定量分析最為理想的方法。研究者將HPLC－MS／MS法用于Caco－2細胞單層轉運實驗樣品的分析［4，5］。本研究建立了一種具有較高靈敏度和準確度的HPLC－MS／MS方法用于測定Caco－2細胞單層轉運實驗樣品中MMF和MPA的濃度，MMF和MPA理化性質差異較大。通過梯度洗脫的方法，優化梯度條件，實現了在同一色譜條件下對兩者的同時檢測。本方法測定的線性范圍為0.01～20.00μmol／L，能夠包括轉運實驗中所有樣品的MMF和MPA濃度，精密度、回收率和穩定性等均能滿足分析測定的要求。本研究使用吲哚美辛作為內標物，而未使用與MPA結構相近的丁氧羧基醚化麥考酚酸（MPAC），主要原因是MPAC的離子碎片會給MMF和MPA的含量測定帶來離子污染，干擾MMF和MPA低濃度時的測定。由于對照品的量較少，本研究以對照品直接加入二甲亞砜中配制對照品儲備液。

轉運介質中高濃度鹽會導致離子抑制作用，影響檢測靈敏度。因此，在分析測定時需要脫鹽處理，應在樣品進入質譜離子源之前去除無機鹽，以避免出現檢測信號抑制及離子源污染［6］。離子抑制實驗結果表明，HBSS溶液中無機鹽的存在對MMF檢測有較大影響，對MPA檢測影響較小。通過軟件系統控制，在樣品進入質譜離子源之前使用切換閥可以將HBSS溶液中大部分的鹽份切換至廢液，顯著提高檢測信號強度，但殘留的少量鹽份仍然會導致一定的離子抑制作用。因此為了獲得有關MMF、MPA穿過Caco－2細胞單層轉運的準確信息，所有樣品應維持相同的無機鹽含量。

［1］ Allison A C，Eugui E M.Mechanisms of action of mycophenolate mofetil in preventing acute and chronic allograft rejection［J］.Transplantation，2005，80（2Suppl）：S 181－S 190.

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