原發性腎上腺皮質腫瘤組織中間隙連接蛋白32和43的表達及其臨床意義

夏照明,朱陳輝,萬克松,胡衛列△

(1.南方醫科大學研究生學院,廣州 510515;2.中國人民解放軍廣州軍區廣州總醫院泌尿外科 510010)

原發性腎上腺皮質腫瘤組織中間隙連接蛋白32和43的表達及其臨床意義

夏照明1,朱陳輝2,萬克松2,胡衛列2△

(1.南方醫科大學研究生學院,廣州 510515;2.中國人民解放軍廣州軍區廣州總醫院泌尿外科 510010)

目的研究間隙連接蛋白(Cx)32和43在原發性腎上腺皮質腫瘤中的表達,探討其在原發性腎上腺皮質腫瘤的臨床診斷及預后評估中的價值?方法 應用免疫組化NovolinkTMPolymer法檢測21份正常腎上腺組織?45份腎上腺皮質腺瘤及14份腎上腺皮質癌標本中Cx32?Cx43的表達水平,運用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理?結果Cx32和Cx43在腎上腺皮質癌中表達陽性率分別為21.4%和35.7%,明顯低于腎上腺皮質腺瘤中的68.9%和75.6%(P=0.002,P=0.010)及正常腎上腺組織中的85.7%和100%(P=0.000,P=0.000);腎上腺皮質腺瘤中Cx43表達的陽性率低于正常腎上腺組(P=0.013)?Cx43的表達與腎上腺皮質腺癌患者的預后相關(P0.05),Cx43表達越低患者預后越差?在腎上腺皮質癌中,Cx32和Cx43之間的表達呈明顯正相關(P=0.015)?結論聯合檢測Cx32和Cx43的表達對鑒別良?惡性腎上腺皮質腫瘤具有重要的參考意義?Cx43在原發性腎上腺皮質癌組織的表達與患者預后相關,增加其表達可能改善患者預后?

腎上腺皮質腺瘤;腎上腺皮質癌;連接蛋白類

脊椎動物的間隙連接(gap junction,GJ)是由不同的間隙連接蛋白(connexin,Cx)構成的細胞連接通道?目前為止,在人體內發現并命名的Cx已達21種,其介導的細胞間隙連接通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)可在細胞間傳遞生物信號和能量,從而調控細胞的新陳代謝?增殖和分化,對維持機體的正常功能具有重要作用,近年來國內外研究發現,Cx表達水平的下降?喪失及異位表達與惡性腫瘤的發生?發展密切相關,而通過轉染使Cx基因正常表達可以抑制腫瘤的生長?侵襲及轉移?已知Cx32和Cx43在正常腎上腺中均有表達,但Cx32和Cx43在原發性腎上腺皮質腫瘤方面的研究,國內外少有報道?本研究通過觀察Cx32和Cx43在正常腎上腺組織?腎上腺皮質腺瘤和腎上腺皮質癌組織中的表達,探討間隙連接蛋白Cx32和Cx43與原發性腎上腺皮質腫瘤發生?發展的關系及其臨床應用價值?

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集1990年4月至2010年12月在中國人民解放軍廣州軍區廣州總醫院經開放或腹腔鏡手術切除的59例典型的腎上腺腫瘤患者標本,患者均有完整的臨床資料和隨訪結果,術前均未接受化療及放療?全部腫瘤標本經病理證實,結合臨床資料確定其中腎上腺皮質腺瘤45例,腎上腺皮質癌14例?正常腎上腺組織標本21份,為中國人民解放軍廣州軍區廣州總醫院泌尿外科行尸體腎移植取腎源時所取的腎上腺組織,經HE染色證實為正常腎上腺組織?所有組織標本統一采用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,組織切片厚度為2.5μm?本組病例腎上腺皮質腺瘤組中,男19例,女26例;腎上腺皮質癌組中,男10例,女4例?腎上腺皮質腺瘤患者除手術治療外,未加化療?放療及其他特殊治療;腎上腺皮質癌患者隨訪時間126～2 319d,其中死亡10例(2例死于非腫瘤原因),4例健康存在?

1.2 方法

1.2.1 試劑 Cx32?Cx43多克隆抗體購自北京博奧生物工程有限公司,NovolinkTMPolymer試劑盒購于北京中衫金橋生物工程有限公司,免疫組織化學采用NovolinkTMPolymer法,Cx32?Cx43稀釋濃度均為1∶300(稀釋劑為一抗稀釋液)?

1.2.2 染色步驟 切片用二甲苯常規脫蠟,梯度乙醇和蒸餾水水化?0.5%H2O2封閉內源性過氧化酶10min,自來水沖洗,蒸餾水沖洗,0.01mol/L?pH=6.0的檸檬酸緩沖液進行高溫修復抗原2min,冷水降溫后自然冷卻,PBS沖洗,滴加RE7102抑制內源性過氧化物酶5min,PBS沖洗3次(每次5min),滴加一抗4℃ 冰箱內孵育過夜,PBS洗3次(每次5min),滴加一抗后封閉劑(RE7111)孵育切片30min,PBS洗3次(每次5min),滴加二抗(NovolinkTM聚合物)孵育切片30min,PBS洗3次(每次5min),二氨基聯苯胺(DAB)顯色5min,自來水洗,蒸餾水洗,蘇木精復染2min或不復染,自來水洗?脫水,透明,封片?以 0.01mol/L PBS(pH 7.4)代替一抗為陰性對照,分別以已知陽性的正常肝組織?正常腎上腺組織切片作Cx32和Cx43的陽性對照?

1.2.3 結果判定 分別由兩名經驗豐富的病理科醫師在不知臨床和病理資料的情況下獨立閱片,光鏡下細胞膜或細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性細胞標志?Cx32和Cx43表達結果的判斷方法一致,即在高倍鏡下隨機選擇10個視野,計數200個細胞,計算陽性細胞百分率,陽性細胞數小于10%為陰性(-),10%～25%為弱陽性(+),25%～50%為中等陽性(++),≥50%的為強陽性(+++)?

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理?率的比較采用四格表的χ2檢驗,各因素間的相關性用Spearmen等級相關分析進行,生存分析用Cox比例風險回歸模型進行?以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 Cx32?Cx43在各種組織中的表達結果 Cx32?Cx43主要表達于細胞膜和細胞質內,細胞核內無表達,在正常腎上腺組織中主要表達于束狀帶及網狀帶,球狀帶較少表達?Cx32在正常腎上腺組織?腎上腺皮質腺瘤及腎上腺皮質癌組織中的陽性表達率分別為85.7%?68.9%?21.4%?Cx43在正常腎上腺組織?腎上腺皮質腺瘤及腎上腺皮質癌組織中的陽性表達率分別為100%?75.6%?35.7%?Cx32?Cx43在腎上腺皮質癌組織中的陽性表達率明顯低于腎上腺皮質腺瘤及正常腎上腺組織,差異有統計學意義(P0.05)?腎上腺皮質腺瘤中Cx43的陽性表達率低于正常腎上腺組織(P0.05),腎上腺皮質腺瘤中Cx32的陽性表達率與正常腎上腺組織比較差異無統計學意義(P0.05)?見插Ⅱ圖1?2及表1?

表1 Cx43和Cx32在各種組織中的表達結果(n)

2.2 Cx32?Cx43的表達與腎上腺皮質癌患者臨床病理的關系Cx32?Cx 43與腎上腺皮質癌患者的年齡?性別?腫瘤的臨床分期無明顯相關性(P0.05),見表2?

2.3 Cx32?Cx43的表達與腎上腺皮質癌患者預后的關系 14例腎上腺皮質癌患者死亡10例,利用Cox回歸模型進行多因素生存分析,Cx32與原發性腎上腺皮質癌的預后無關(P0.05);Cx43與原發性腎上腺皮質癌的預后有相關性(P0.05),Cx43表達越低,患者預后越差?

表2 Cx43和Cx32表達結果與臨床病理特征的關系

2.4 腎上腺皮質癌中Cx32?Cx43表達的關系 11例Cx32陰性的腎上腺皮質癌中有9例Cx43呈陰性,5例Cx43陽性的腎上腺皮質癌中3例Cx32呈陽性?單因素相關分析結果表明,Cx32和Cx43之間的表達呈明顯的正相關(r=0.646,P=0.013)?

3 討 論

腎上腺皮質癌是一種比較罕見的腎上腺惡性腫瘤,年發病率為1～2/100萬,40%的患者在診斷時已有遠處轉移,從影像學上難以診斷,腎上腺皮質癌的組織結構與形態和腎上腺皮質腺瘤皮質相像,從病理形態及臨床表現鑒別腎上腺皮質腫瘤的良?惡性亦比較困難,因此非常有必要從蛋白水平上對腎上腺皮質腫瘤進行研究,探討其生物學行為,為臨床診斷及治療提供理論依據?

GJ普遍存在于脊椎動物體內,是細胞連接的一種,由相鄰細胞膜上的Cx構成?GJIC介導相鄰細胞電信號的直接傳遞,以及營養物質?代謝產物?離子?第二信使?相對分子質量小于1000的親水性物質的交換[1],GJIC在胚胎發育?細胞分化和增殖?內環境穩定以及細胞間活動協調等方面具有重要作用?研究證實Cx表達異常與腫瘤的增殖?侵襲?轉移有密切關系[2],范松青等[3]采用組織微陣列與免疫組織化學染色研究發現多種腫瘤存在Cx的表達異常?

人的Cx32基因定位在X染色體Xp11.q22_上,其相對分子質量為32×103,主要表達在正常的肝細胞的細胞膜上,在泌尿系統中也有不同程度表達?Cx32作為一種抑癌基因在腎癌的發生?發展?治療中的作用研究較多[4],而在腎上腺方面的研究主要集中在動物實驗[5],Willenberg等[6]研究發現 Cx32主要表達于腎上腺皮質區,在腎上腺髓質及腎上腺髓質腫瘤沒有表達?本研究發現Cx32在腎上腺皮質組織?腎上腺皮質腺瘤,腎上腺皮質癌表達的陽性率分別為85.7%?68.9%?21.4%,Cx32在腎上腺皮質癌表達的陽性率明顯低于腎上腺皮質腺瘤及正常腎上腺組織,差異有統計學意義(P0.05);Cx32與腎上腺皮質癌患者的臨床分期?性別?年齡以及預后均無相關性(P0.05)?

Cx43是第一個被克隆的Cx,其相對分子質量為43×103,人的組織中的Cx43存在兩個基因位點,一個表達基因定位在6號染色體上,另一個假基因(pseudogene)定位在5號染色體上?Cx43是Cx中研究最多的一種蛋白,Cx43在膀胱移行細胞癌[7]?非精原細胞瘤[8]?子宮內膜癌[9]?胃癌[10]等 惡性 腫瘤的下調表達已有報道?Murry等[11]研究發現Cx43主要表達于腎上腺皮質的網狀帶及束狀帶,在腎上腺髓質沒有表達或微弱表達,Cx43在腎上腺皮質癌表達的陽性率明顯低于腎上腺皮質腺瘤及正常腎上腺組織?本研究發現Cx43在腎上腺皮質組織?腎上腺皮質腺瘤及腎上腺皮質癌表達的陽性率分別為100%?75.6%?35.7%,Cx43在腎上腺皮質癌表達的陽性率明顯低于腎上腺皮質腺瘤及正常腎上腺組織,差異有統計學意義(P0.05);生存分析顯示,Cx43與腎上腺皮質癌患者的預后相關(P0.05),Cx43表達的陽性率越低,患者的預后越差?

大量研究表明,Cx異常表達和GJIC功能缺陷與多種腫瘤的惡性增殖和轉化密切相關?近年來,利用基因敲除及負顯性抑制技術(dominant negative)阻斷Cx基因的表達,導致細胞失去對生長的控制,從而形成腫瘤,因此Cx家族基因也被認為是腫瘤抑制基因[12]?Cx抑制腫瘤發生的機制目前尚不明確,McLanhlan等[13]研究發現增加 MDA-MB-231乳腺癌細胞中Cx26?Cx43的表達可以抑制腫瘤的發生?Langlois等[14]研究發現Cx43抑制腫瘤的發生與小凹蛋白(caveolin-1)密切相關?目前研究還發現Cx的強制表達可以使得N-粘蛋白表達下降及增加MDA-MB-43乳腺癌細胞對凋亡的敏感性,從而抑制腫瘤轉移[15]?作者推測GJ減少或者喪失使機體的調控信息不能有效傳遞到細胞,細胞間信號得不到交換,細胞內環境失平衡,細胞功能異常等,這一系列變化導致細胞無限制增殖,從而導致腫瘤的發生?

本實驗采用免疫組化的方法對腎上腺皮質腫瘤中Cx32?Cx43的表達進行初步的研究,并將Cx32?Cx43的表達與患者臨床資料進行了統計學分析,研究結果顯示Cx32?Cx43與腎上腺腫瘤的發生?發展有一定的關系,二者之間呈正相關,其相互作用的機制有待進一步研究?本研究提示臨床中聯合檢測腎上腺腫瘤組織中Cx32?Cx43的表達對鑒別腎上腺皮質腫瘤的良?惡性有一定的參考價值,檢測腎上腺皮質癌中Cx43的表達對判斷患者的預后有一定的指導意義?

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Expression and clinical significance of Cx32 and Cx43 in primary adrenal cortical tumors

,,,
(1.,,510515,;2.,,,510010,)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of connexin 32and connexin 43proteins in adrenal tumors.MethodsThe expression of connexin 32and connexin 43in 80specimens including 21cases of normal adrenal gland,45cases of cortex adenoma and 14cases of cortex adenocarcinoma,were detected by NovolinkTMPolymer immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of connexin 32and connexin 43were 21.4% ,35.7%in cortex adenocarcinoma which were significantly lower than 68.9%and 75.6%respectively in cortex adenoma(P=0.002,P=0.010)and it also lower than 85.7%and 100%respectively in normal adrenal gland(P=0.000,P=0.000).The positive rate of connexin 43was 75.6%in cortex adenoma which was significantly lower than 100%in normal adrenal gland(P=0.013).The positive expression of connexin 43was negative correlated with the prognosis of adrenal cortex adenocarcinoma:the lower expression intensity of connexin43,the worse the patients prognosis(P0.05).Incortex adenocarcinoma,the expression of connexin 32was positive correlated with the expression of connexin 43.ConclusionMeasurements of connexin 43and connexin 32may helpful to distinguish malignant from non-malignant tumors.Expression of connexin 43is closely correlated to the prognosis of patients,increasing the expression of connexin 43may improve the patients prognosis.

adrenocortical adenoma;adrenocortical carcinoma;connexins

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.013

A

1671-8348(2012)18-1824-03

△通訊作者,E-mail:Huwl-mr@vip.sina.com?

2012-01-09

2012-05-22)

?臨床研究?