氧化苦參堿對(duì)LoVo細(xì)胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達(dá)的影響

韓 凌,彭 燕,孫 靜,危建安

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510006;2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院,廣東珠海 519100)

氧化苦參堿對(duì)LoVo細(xì)胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達(dá)的影響

韓 凌1,彭 燕2,孫 靜1,危建安1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510006;2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院,廣東珠海 519100)

目的探討氧化苦參堿(OM)抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的分子作用機(jī)制?方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法以及免疫組化法檢測(cè)OM對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡相關(guān)以及細(xì)胞骨架相關(guān)的B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)?微管蛋白1A(TUBA1A)?咬合蛋白(OCLN)的基因及蛋白表達(dá)的影響?結(jié)果OM能顯著抑制LoVo細(xì)胞增殖;可明顯抑制LoVo細(xì)胞Bcl-2的mRNA以及蛋白的表達(dá)(P0.05),抑制TUBA1AmRNA表達(dá),同時(shí)上調(diào)OCLN蛋白的表達(dá),但并不能明顯上調(diào)OCLN mRNA的表達(dá)?結(jié)論OM抑制LoVo細(xì)胞增殖,可能與下調(diào)LoVo細(xì)胞Bcl-2?TUBA1A表達(dá)以及上調(diào)OCLN表達(dá)有關(guān)?

腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞骨架;氧化苦參堿

氧化苦參堿(oxymatrine,OM)是豆科槐屬植物苦參(SophoraflavescensAit.)?苦豆子(S.AlopecuroidesL.)?廣豆根(S.SubprostrataChun)等中草藥的有效活性成分?體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究已表明,OM對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有抑制細(xì)胞增殖?誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[1-3]?以O(shè)M為主要成分的注射液具有明確的抗腫瘤作用,已廣泛的應(yīng)用于臨床,但確切的分子機(jī)制并不明確?因OM可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量發(fā)生變化,作者推測(cè)OM的作用機(jī)制可能與影響腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞骨架相關(guān)基因及蛋白表達(dá)有關(guān)?本研究選擇人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞為研究對(duì)象,采用熒光定量PCR以及免疫組化法觀察OM對(duì)LoVo細(xì)胞B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)?微管蛋白1A(tubulin alpha 1A,TUBA1A)?咬合蛋白(occludin,OCLN)等基因表達(dá)的影響,為OM在臨床治療上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 LoVo細(xì)胞為武漢中國(guó)生物品典藏中心保存,氧化苦參堿購(gòu)于陜西一星生物制劑公司,胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,OCLN抗體購(gòu)于Abcom公司,Bcl-2抗體?免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中衫金橋公司,MEM培養(yǎng)液?PBS?0.25%胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司,PrimeScriptTM RT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM試劑購(gòu)于大連Takara公司,熒光定量PCR儀購(gòu)于ABI公司,高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于Beckman公司,CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo公司,倒置顯微鏡購(gòu)于日本NIKON公司,超凈工作臺(tái)購(gòu)于新加坡ESCO公司?

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配制 人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素),于37℃?飽和濕度?5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞消化采用0.25%含EDTA胰蛋白酶?OM采用無(wú)血清MEM配制成濃度為20mg/mL儲(chǔ)存液,0.22μm一次性濾器過(guò)濾?-20℃避光保存?zhèn)溆?使用時(shí)配成終濃度為2mg/mL?

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分3組,分別是:空白對(duì)照組(不加任何藥物)?高劑量 OM 組(2mg/mL)及TNF-α組(100ng/mL);免疫組化檢測(cè)分為3組,分別是:空白對(duì)照組(不加任何藥物)?高劑量OM組(2mg/mL)及低劑量OM組(1mg/mL)?各組均在細(xì)胞培養(yǎng)24h后加藥,加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?

1.2.3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,加藥培養(yǎng)24h后,棄去培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS洗滌1次,棄去PBS后加入1mL TRIzol并收集細(xì)胞,按說(shuō)明書操作提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm及280nm處吸光度值(A260?A280),計(jì)算RNA樣品的純度和濃度?按操作說(shuō)明書合成cDNA?按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系20μL,擴(kuò)增條件:95℃30s預(yù)變性,95℃變性5s,60℃退火34s,40個(gè)循環(huán),每份樣品做復(fù)孔?mRNA相對(duì)表達(dá)量用比較Ct值法計(jì)算,以看家基因GAPDH為內(nèi)參,用看家基因和靶基因Ct值差(ΔCt)計(jì)算靶基因相對(duì)看家基因GAPDH 表達(dá)量[1/(2ΔCt)],與空白對(duì)照組比較,計(jì)算其他各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量(Ratio)?引物應(yīng)用Invitrogen公司在線軟件Oligo PerfectTMDesigner設(shè)計(jì),用BLAST進(jìn)行比對(duì),由Invitrogen公司合成,實(shí)驗(yàn)用引物相關(guān)情況見表1?

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.4 免疫組化檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行?4%多聚甲醛固定細(xì)胞后自然吹干,加1～2滴3%H2O2去離子水孵育10min,PBS洗3次,每次2min;將玻片吹干,每張玻片上滴加100μL×1/100Bcl-2,4℃冰箱孵育過(guò)夜;第2天取出,PBS洗3次,每次2min,加PV-6000 37℃孵育30min,PBS洗3次,每次2min;加DAB顯色,流水清洗,晾干;中性樹膠固定;顯微鏡觀察拍照?顯色為棕色顆粒時(shí)表示特異蛋白陽(yáng)性表達(dá)?

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 特異基因mRNA表達(dá)結(jié)果采用t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 相關(guān)基因的特異性引物溶解曲線及擴(kuò)增曲線 基因擴(kuò)增后,Bcl-2?OCLN?TUBA1A和 GAPDH 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線?擴(kuò)增曲線見圖1?2?各基因擴(kuò)增曲線均呈明顯的S型曲線,擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線均為特異高尖的信號(hào)峰,說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一,無(wú)非特異性擴(kuò)增片段?

圖1 各基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線

圖2 各基因擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線

2.2 OM 對(duì) LoVo細(xì)胞 Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA 表達(dá)的影響 加藥培養(yǎng)24h后,高劑量OM 組Bcl-2?TUBA1A mRNA明顯下調(diào),與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OCLN有上調(diào)趨勢(shì),但與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?TNF-α組 Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達(dá)的作用趨勢(shì)與高劑量OM組一致,但與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?見表2?

表2 OM 對(duì)LoVo細(xì)胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達(dá)的影響(±s,n=3)

表2 OM 對(duì)LoVo細(xì)胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達(dá)的影響(±s,n=3)

*:P0.05,與空白對(duì)照組相比?

組別Bcl-2 OCLN TUBA1A空白對(duì)照組1.285±0.224 1.93±0.722 1.135±0.116高劑量 OM 組 0.799±0.139* 2.666±0.869 0.616±0.022*TNF-α組1.002±0.054 2.788±0.515 0.998±0.104

2.3 OM對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 Bcl-2主要表達(dá)于LoVo細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量較多,胞質(zhì)內(nèi)可見明顯棕色染色;加藥培養(yǎng)24h后,低劑量OM組LoVo細(xì)胞數(shù)量明顯減少,與空白對(duì)照組比較,胞質(zhì)內(nèi)僅見淺黃棕色染色;高劑量OM組僅見少量LoVo細(xì)胞留存,棕色顆粒表達(dá)明顯下調(diào)?研究結(jié)果表明OM可明顯下調(diào)LoVo細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)?見封2圖3?

2.4 OM對(duì)OCLN蛋白表達(dá)的影響 選取高?低劑量OM,分別作用LoVo細(xì)胞24?48h,觀察OM對(duì)OCLN蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果見封2圖4及插Ⅰ圖5?OCLN主要表達(dá)于LoVo細(xì)胞膜上及胞質(zhì)內(nèi)?空白對(duì)照組LoVo細(xì)胞OCLN表達(dá)較少?加藥培養(yǎng)24h后,低劑量OM組可見OCLN表達(dá)明顯增多,細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒明顯增多,染色加深;隨著OM劑量的加大,細(xì)胞染色也逐漸加深?加藥培養(yǎng)48h后,高?低劑量OM組細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于空白對(duì)照組明顯減少,而細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕色顆粒隨劑量增加而逐漸增加?研究表明,OM可明顯上調(diào)LoVo細(xì)胞OCLN蛋白的表達(dá)?

3 討 論

3.1 OM對(duì)LoVo細(xì)胞Bcl-2基因及蛋白表達(dá)的影響 人的Bcl-2基因是從大多數(shù)濾泡型非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤中分離獲得的?1988報(bào)道Bcl-2基因可使細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)?1990年進(jìn)一步確證Bcl-2基因具有抗細(xì)胞凋亡的功能后,Bcl-2基因作為重要的凋亡抑制基因,在多種腫瘤中得到證實(shí)?近年來(lái)的研究表明,Bcl-2基因的異常表達(dá),與肺癌的發(fā)生?發(fā)展?預(yù)后以及腫瘤耐藥密切相關(guān)[4]?徐康等[5]發(fā)現(xiàn)羥喜樹堿可誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡,同時(shí)下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá),從而起到抗結(jié)腸癌細(xì)胞的作用?本研究表明,OM可下調(diào)Bcl-2基因表達(dá);同時(shí)用免疫組化方法進(jìn)一步證實(shí)OM可下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),提示OM誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡與影響B(tài)cl-2基因與蛋白表達(dá)有關(guān)?

3.2 OM對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞TUBA1A基因及蛋白表達(dá)的影響 腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力是浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的先決條件?細(xì)胞骨架被認(rèn)為是生長(zhǎng)因子參與和作用的多種細(xì)胞反應(yīng)的最初靶結(jié)構(gòu)?作為細(xì)胞骨架主要成分之一的微管,在細(xì)胞形態(tài)的維持?細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用?目前在真核生物中已經(jīng)確定的微管蛋白有7種,其中a-tubulin和β-tubulin是微管結(jié)構(gòu)的主要組成,在真核生物細(xì)胞中普遍存在,并且高度保守性[6]?研究表明,tubulin表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中增高可能表示預(yù)后不良,而且微管蛋白是紫杉醇作用的位點(diǎn),與紫杉醇的獲得性耐藥也密切相關(guān)?tubulin的表達(dá)與紫杉醇化療敏感性相關(guān),tubulin表達(dá)降低則對(duì)紫杉醇敏感性增加[7-8]?本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OM可明顯下調(diào)TUBA1AmRNA表達(dá),推測(cè)OM可能通過(guò)影響TUBA1A表達(dá)而影響LoVo細(xì)胞的形態(tài)以及運(yùn)動(dòng)能力?而OM能否提高LoVo細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性仍需進(jìn)一步研究?

3.3 OM對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞OCLN基因及蛋白表達(dá)的影響 腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位解離是腫瘤侵襲?轉(zhuǎn)移過(guò)程的第1個(gè)及重要環(huán)節(jié)?而明確細(xì)胞解離機(jī)制則有利于闡明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,并探索限制癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的治療新方法?緊密連接是細(xì)胞間連接處的復(fù)雜結(jié)構(gòu),在細(xì)胞間黏著等生理學(xué)功能方面起重要作用?緊密連接與細(xì)胞癌變有關(guān),在上皮衍生癌中經(jīng)?？砂l(fā)現(xiàn)緊密連接結(jié)構(gòu)缺失?電子顯微鏡證實(shí),緊密連接在細(xì)胞癌變中逐漸減少?OCLN是被克隆的緊密連接的第1個(gè)轉(zhuǎn)膜蛋白,其不僅是緊密連接的結(jié)構(gòu)成分,同時(shí)也是功能成分?OCLN作為緊密連接的重要轉(zhuǎn)膜蛋白可能在細(xì)胞解離過(guò)程中起重要作用[9]?OCLN在胃腸分化腺癌中的表達(dá)水平與正常上皮細(xì)胞一致,但在低分化腺癌中表達(dá)水平顯著降低[10]?朱光能等[11]運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)OCLN在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá),并分析OCLN表達(dá)與肝癌發(fā)生?發(fā)展的關(guān)系?結(jié)果表明OCLN主要定位于肝細(xì)胞膜,肝細(xì)胞癌與癌旁肝組織相比,OCLN表達(dá)陽(yáng)性率及其強(qiáng)度均明顯下降,其改變?cè)诟渭?xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用?本研究發(fā)現(xiàn)OM可上調(diào)OCLN基因表達(dá),采用免疫組化方法進(jìn)一步證實(shí)OM可上調(diào)OCLN蛋白表達(dá),本研究結(jié)果提示,OM可能通過(guò)影響OCLN的基因與蛋白的表達(dá),從而恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中被破壞的緊密連接,影響腫瘤細(xì)胞的遷移,而起到抗腫瘤的作用?

綜上所述,OM抑制LoVo細(xì)胞增殖的作用,可能與下調(diào)細(xì)胞Bcl-2基因和蛋白表達(dá)有關(guān)?另外,OM也可能通過(guò)下調(diào)TUBA1A,上調(diào)OCLN基因表達(dá),從而影響LoVo細(xì)胞的形態(tài)?細(xì)胞周期以及運(yùn)動(dòng)與遷移的能力,而發(fā)揮抗癌的作用?

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Effects of oxymatrine on expressions of Bcl-2,OCLN and TUBA1A in human colon carcinoma LoVo cells

,,,
(1.,,510006,;2.,,519100,)

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of oxymatrine(OM)on inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human colon carcinoma LoVo cells.MethodsUsing fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry assay to detect the effects of OM on apoptosis and cytoskeleton-related molecular gene and protein expression,such as Bcl-2,OCLN,TUBA1Aon LoVo cells.ResultsOM could inhibit LoVo cells proliferation and significantly inhibit Bcl-2gene and protein expression on LoVo cells.OM could also significantly inhibit TUBA1Agene expression on LoVo cells.OM showed only a slight increase trend on OCLN gene expression,but with immunohistochemical assay OM could significantly increase the OCLN protein expression on LoVo cells.ConclusionThe molecular mechanism of OM to inhibit tumor cell proliferation may be related to down-regulate Bcl-2and TUBA1Aexpression while increased expression of OCLN on LoVo cells.

tumor cells,cultured;apoptosis;cytoskeleton;oxymatrine

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.007

A

1671-8348(2012)18-1805-03

2011-10-09

2012-03-06)

?臨床研究?