螺內酯對清蛋白誘導人腎小管上皮細胞轉分化的影響*

危志強,秦曉華,徐承云,鄒宏昌,徐高四,占錦峰,涂衛平

(南昌大學第二附屬醫院腎內科 330006)

螺內酯對清蛋白誘導人腎小管上皮細胞轉分化的影響*

危志強,秦曉華,徐承云,鄒宏昌,徐高四,占錦峰,涂衛平△

(南昌大學第二附屬醫院腎內科 330006)

目的探討螺內酯對人清蛋白誘導的人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞)發生轉分化的影響,以及該過程是否通過轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smads信號通路發揮作用?方法 體外培養HK-2細胞,將其隨機分為7組:A組(未加刺激物)?B組(加入10-7mol/L螺內酯)?C組(加入5mg/mL清蛋白)?D組(加入5mg/mL清蛋白及10-8mol/L螺內酯)?E組(加入5mg/mL清蛋白及10-7mol/L螺內酯)?F組(加入5mg/mL清蛋白及10-6mol/L螺內酯)?G組(先加10μmol/L TGF-β1拮抗劑,30min后加入5mg/mL清蛋白)?采用RT-PCR檢測TGF-β1和整合素連接激酶(ILK)的mRNA表達;細胞免疫熒光檢測上皮鈣黏素(E-cadherin)?α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達;ELISA 法檢測纖維連接蛋白(FN)的蛋白水平?結果C組ILK mRNA,α-SMA?FN蛋白較其他各組表達明顯增高(P0.05),E-cadherin蛋白表達明顯下降(P0.05),而TGF-β1mRNA表達高于除 G組以外其余各組(P0.05)?與 G組相比,C組 TGF-β1mRNA表達差異無統計學意義(P0.05),而ILK mRNA,α-SMA?FN蛋白表達明顯下降(P0.05),E-cadherin表達明顯升高(P0.05)?D?E?F組TGF-β1?ILKmRNA?α-SMA,FN蛋白表達逐漸下降,組間兩兩比較差異有統計學意義(P0.05);E-cadherin的表達逐漸增高(P0.05)?結論一定濃度的清蛋白可以誘導體外培養的HK-2細胞發生轉分化;螺內酯可抑制人清蛋白誘導HK-2細胞轉分化作用,且呈劑量依賴性;TGF-β1/Smads信號通路可能是此過程中的重要通路?

螺內酯;腎小管;上皮細胞;細胞分化;轉化生長因子β

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)進展為終末期腎衰竭的共同病理途經?腎小管上皮細胞(HK-2)轉分化可介導細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的過量沉積,被視為RIF發生?發展的重要機制?研究表明,蛋白尿是導致RIF的獨立危險因素?大量清蛋白在體外可誘導HK-2發生轉分化[1]?近年來一些研究已證實螺內酯具有抑制肌成纖維細胞轉分化?減少蛋白尿?抑制ECM堆積等作用?有實驗表明螺內酯可抑制高糖誘導的HK-2細胞發生轉分化[2],但對清蛋白誘導的HK-2發生轉分化是否有影響,目前尚無報道?本實驗通過使用人清蛋白刺激導腎小管上皮細胞,并使用不同濃度螺內酯進行干預,檢測轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)?整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)mRNA,上皮鈣黏素(E-cadherin)?α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)?纖維連接蛋白(fibronectin,FN)蛋白水平等表達情況,以探討螺內酯對清蛋白誘導的HK-2細胞發生轉分化的影響及其可能的作用機制?

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HK-2細胞由中山大學第一附屬醫院余學清教授惠贈;胎牛血清(FBS)?TRJzol DMEM/F12培養基為美國Gibco公司產品;人純化清蛋白為北京Solarbio公司產品;螺內酯為美國Sigma產品;單克隆小鼠抗人TGF-β1中和抗體為R&D公司產品;ELISA試劑盒為上海森雄公司產品;兔抗人E-cadherin抗體?兔抗人α-SMA蛋白抗體?FIFC標記羊抗兔二抗為上海博奧森公司產品;RevertAidTM逆轉錄試劑盒為美國Invitrogen Life Technologies公司產品;5%二氧化碳培養箱為Thermo Forma公司產品;倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品;PCR擴增儀為美國BIOCAD公司產品;核酸?微量蛋白測定儀?凝膠成像和化學發光圖像分析系統為美國BIOCAD公司產品?

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 HK-2細胞培養于規格為25cm2的培養瓶,以10%胎牛血清?含2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12(1∶1)培養基進行培養,培養條件為37℃?5%CO2?倒置顯微鏡下觀察細胞長至融合度為70%～80%時,用無血清的DMEM/F12培養基同步24h后,隨機分為7組,即A組未加刺激物,B組加入10-7mol/L螺內酯,C組加入5mg/mL清蛋白,D組加入5mg/mL清蛋白及10-8mol/L螺內酯,E組加入5mg/mL清蛋白及10-7mol/L螺內酯,F組加入5mg/mL清蛋白及10-6mol/L螺內酯,G組先加10μmol/L TGF-β1拮抗劑,30min后加入5mg/mL清蛋白?實驗重復3次?

1.2.2 RT-PCR檢測 TGF-β1和ILK 的 mRNA 表達 分別收集各組細胞,提取總RNA,均按TRIzol說明書進行?提取物用微量蛋白/核酸測定儀測定RNA純度和濃度?取總RNA 5μL作逆轉錄操作,按RT-PCR試劑盒說明書進行操作,總反應體積為25μL?聚合酶鏈反應引物序列如下,GAPDH:正義鏈5′-AGT CCA CTG GCG TCT TCA C-3′,反義鏈5′-GCT TGA CAA AGT GGT CGT TGA-3′;TGF-β1:正義鏈5′-ACC GCA ACA ACG CAA TCT ATG-3′,反義鏈5′-ATT CCG TCT CCT TGG TTC AGC-3′;ILK:正義鏈5′-GCA CTC AAT AGC CGT AGT G-3′,反義鏈5′-CCT ACT TGT CCT CAT CTT C-3′?反應條件為:預變性95℃4min,擴增94℃30s,退火30s,72℃1min?退火溫度及循環數分別為ILK 55℃,35個循環;TGF-β154℃,35個循環,最后一個循環后72℃延伸5min?取各檢測物PCR產物8μL,1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統成像,用圖像分析處理系統進行灰度掃描分析DNA條帶含量,以所得積分吸光度與內參照GAPDH積分吸光度的比值作為半定量值進行分析?

1.2.3 免疫熒光檢測E-cadherin?α-SMA蛋白的表達 HK-2細胞接種于6孔板備置細胞玻片,各組培養24h后,4%多聚甲醛室溫固定20min?參照試劑盒說明書,滴加E-cadherin單抗?α-SMA蛋白單抗(1∶100)4℃過夜,滴加FITC標記二抗孵育40min,中性樹膠封片?在熒光顯微鏡下觀察,隨機取3個視野觀察,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析E-cadherin?α-SMA積分光密度(IOD)值?

1.2.4 ELISA檢測FN蛋白的水平 根據試劑盒說明書對標準品和細胞培養上清液進行檢測?在酶標儀450nm處,以空白對照孔調零,測取吸光度A值,以A450值對FN標準品(ng/mL)在Excel上作標準曲線,根據表本的A值求出FN含量(ng/mL)?

1.3 統計學處理 用SPSS17.0統計分析軟件進行處理,計量資料數據以±s表示,組間采用單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著差LSD-t檢驗法,以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 細胞TGF-β1和ILK的 mRNA表達結果 A?B組 HK-2細胞TGF-β1和ILK的 mRNA均有微量表達;C組 TGF-β1 mRNA表達水平高于除G組以外其余各組(P0.05),ILK mRNA表達水平較其他各組均明顯增高(P0.05);D?E?F組HK-2細胞TGF-β1和ILK的mRNA表達逐漸下降,兩組間比較差異統計學意義(P0.05);與C組比較,G組 HK-2細胞TGF-β1mRNA 表達差異無統計學意義(P0.05),而ILK mRNA表達明顯下降(P0.05)?見圖1和表1?

圖1 各組HK-2細胞TGF-β1和ILK的mRNA的表達

表1 各組細胞TGF-β1和ILK的mRNA的相對表達量(±s)

表1 各組細胞TGF-β1和ILK的mRNA的相對表達量(±s)

組別 TGF-β1ILK A組0.391±0.015 0.387±0.023 B組 0.385±0.018 0.380±0.030 C組 0.921±0.044 0.662±0.027 D組 0.771±0.017 0.588±0.024 E組 0.590±0.020 0.473±0.017 F組 0.414±0.034 0.407±0.013 G組0.911±0.037 0.384±0.016

2.2 細胞免疫熒光檢測細胞 E-cadherin?α-SMA蛋白的表達

各組 HK-2細胞E-cadherin和α-SMA蛋白均有微量表達;C組HK-2細胞α-SMA蛋白表達較其他各組明顯增高(P0.05),而E-cadherin表達則明顯下降(P0.05);D?E?F組HK-2細胞α-SMA蛋白的表達逐漸下降,E-cadherin蛋白的表達逐漸增高,且組間兩兩比較差異有統計學意義(P0.05);與C組比較,G組 HK-2細胞 E-cadherin表達明顯升高(P0.05),而α-SMA蛋白表達下降(P0.05)?見表2?

表2 各組細胞E-cadherin?α-SMA蛋白的表達(±s)

表2 各組細胞E-cadherin?α-SMA蛋白的表達(±s)

組別 α-SMA E-cadherin A組0.371±0.012 1.076±0.055 B組 0.366±0.015 1.069±0.036 C組 0.943±0.050 0.549±0.008 D組 0.796±0.015 0.631±0.023 E組 0.613±0.019 0.722±0.006 F組 0.422±0.025 0.965±0.039 G組0.709±0.033 0.896±0.017

2.3 ELISA法檢測上清液FN蛋白的水平 C組細胞上清液中FN蛋白的水平顯著高于其他各組(P0.05);D?E?F組上清液中FN蛋白的水平逐漸降低,組間兩兩比較,差異有統計學意義(P0.05);與C組比較,G組上清液中FN蛋白的水平明顯降低(P0.05)?見表3?

表3 各組細胞上清液中FN蛋白的水平(±s,pg/mL)

表3 各組細胞上清液中FN蛋白的水平(±s,pg/mL)

組別FN A組194.04±50.62 B組 205.89±53.77 C組 849.57±124.3 D組 671.81±100.57 E組 550.79±72.03 F組 375.63±84.29 G組583.32±107.45

3 討 論

腎小管上皮細胞轉分化發展為RIF,主要經歷了4個關鍵的階段:(1)上皮細胞間黏附因子(如 E-cadherin)的丟失;(2)間質細胞標記物α-SMA及中間絲波形蛋白表達的增加;(3)細胞骨架重塑及表型的轉變致腎小管基底膜的破壞;(4)細胞遷移侵襲能力增強致間質纖維化的發展[3]?大量研究表明,TGF-β1是誘導腎小管上皮細胞EMT的主要介質,在介導EMT中發揮著至關重要的作用[4],且此作用依賴Smads信號通路[5]?ILK是一種位于細胞內主要調節細胞黏附?細胞形態以及細胞外基質沉積的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,很多臨床表現為蛋白尿的腎臟病模型的研究發現ILK是蛋白尿發生的關鍵性介 質 之 一[6-7]?TGF-β1可 促 進ILK 表 達[8]?研究表 明,ILK作為TGF-β1/Smads信號通路的下游因子參與了EMT的4個關鍵步驟[9]?E-cadherin是腎小管上皮細胞轉分化過程中的重要的標記蛋白之一[10],其表達的下調被視為是腎小管上皮細胞發生EMT的第一步,是腎間質纖維化的始動環節[11-12]?實 驗 表 明,ILK 表 達 的 增 加 使 E-cadherin表 達 下 調,并上調α-SMA及FN的表達[13]?

本研究觀察提示清蛋白誘導組的TGF-β1?ILK mRNA,α-SMA?FN蛋白的表達較其他組均明顯上調,而E-cadherin表達較其他組明顯下調?說明大量清蛋白在體外誘導HK-2細胞發生EMT?此結果與文獻報道[1]有相似?另外,在螺內酯干預組中,隨著螺內酯濃度的加大,TGF-β1?ILK mRNA?α-SMA蛋白?FN蛋白的表達均有所下調,E-cadherin表達上調?螺內酯可一定程度的抑制清蛋白誘導的 HK-2細胞發生EMT,而且呈一定的劑量依賴性?與此同時實驗發現,TGF-β拮抗劑組較清蛋白誘導組的ILK mRNA表達明顯下調,而E-cadherin?α-SMA蛋白?FN蛋白的有所下調,TGF-β1表達無明顯差異?此結果與Bianchi S等研究報道相似[14]?作者認為此過程可能有TGF-β1/Smads信號通路參與,并可能為主要通路?

螺內酯是醛固酮非選擇性拮抗劑,與其在細胞質膜的鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)的水平上發生直接的拮抗作用,具有利尿?降低血壓等作用?在臨床研究中發現,給予CKD患者服用8周螺內酯后,可以顯著降低其蛋白尿的水平[14];部分研究證實小劑量螺內酯聯合ACEI尚可以有效減少CKD的尿蛋白排泄[15]?動物實驗表明,醛固酮選擇性拮抗劑也能顯著降低糖尿病大鼠腎臟組織MR mRNA的表達,從而減少蛋白尿[16];Taira等[17]報告螺內酯在單腎切除的糖尿病大鼠中,可降低腎組織TGF-β1,減緩小管間質纖維化?筆者認為本實驗從細胞分子水平上,進一步闡述了螺內酯對清蛋白導致腎臟損害的保護作用?但其具體作用機制有待進一步研究?

綜上所述,清蛋白可上調 TGF-β1?ILK mRNA和α-SMA?FN蛋白,而下調E-cadherin蛋白表達,螺內酯則反之,提示一定濃度的人清蛋白可以誘導體外培養的 HK-2細胞發生EMT,螺內酯可一定程度的抑制此過程?另外本實驗提示;螺內酯抑制清蛋白誘導的HK-2發生EMT呈一定的劑量依賴性,而且與TGF-β1/Smads信號通路有關?但其具體的作用機制仍不明確?本實驗提示螺內酯對腎臟疾病具有保護效應,為尋找緩解腎臟疾病進展的新策略有一定意義?

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Effects of spironolactone on albumin induced transdifferentiation of human renal tubular epithelial cells*

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ObjectiveTo discuss the effects of spironolactone(SPI)on albumin(Alb)induced transdifferentiation of human kidney proximal renal tubular epithelial cells(HK-2cells),and whether the process through TGF-β1/Smads signaling pathways.MethodsIn vitro HK-2cells were randomly divided into the following seven groups:group A (without stimulus),group B (10-7mol/L SPI),group C(5mg/mL Alb),group D (5mg/mL Alb+ 10-8mol/L SPI),group E (5mg/mL Alb+ 10-7mol/L SPI),group F(5mg/mL Alb+10-6mol/L SPI),group G (10μmol/L TGF-β1antagonist)30min later adding 5mg/mL Alb).Using RT-PCR to detect TGF-β1and ILK mRNA expressions;Immunofluorescence detection in E-cadherin andα-SMA proteins expression;ELISA assay for detection of FN protein levels.ResultsIn group C,compared with other groups,ILK mRNA andα-SMA,FN proteins expression were higher than other groups(P0.05),but E-cadherin protein express declined obviously(P0.05),at the same time,TGF-β1mRNA expression was higher than other groups except group G(P0.05).Compared with the group G,TGF-β1mRNA expression of group C was no obviously difference(P0.05),but ILK mRNA andα-SMA,E-cadherin,FN proteins expression were distinctly decreased(P0.05).In group D,E,F,TGF-β1,ILK mRNA andα-SMA,FN proteins expressions had descended gradually(P0.05).Compared with any two of them,these expressions had obviously decreased(P0.05).On the contrary,E-cadherin expression was in the opposite direction(P0.05).ConclusionA certain concentration of albumin can be induced transdifferentiation of HK-2cells in vitro.Spironolactone inhibits this process in a dose-dependent manner.TGF-β1/Smads signaling pathway may be play an important role in this process.

spironolactone;kidney tubules;epithelial cells;cell differentiation;transforming growth factor beta

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.005

A

1671-8348(2012)18-1799-03

* 基金項目:江西省衛生廳科技計劃(20121077)?△

;Tel:(0791)86291976;E-mail:tuweiping6102@sina.com?

2012-01-09

2012-03-02)

?基礎研究?