不同類型淋巴瘤患者腫瘤壞死因子-β的表達及其臨床意義*

陳海霞,鄒紅云,顧 霞△,蓋玉萍,晁亞妮

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院病理科,烏魯木齊 830054;2.蘭州軍區烏魯木齊總醫院臨床醫學研究所 830000)

不同類型淋巴瘤患者腫瘤壞死因子-β的表達及其臨床意義*

陳海霞1,鄒紅云2,顧 霞1△,蓋玉萍2,晁亞妮2

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院病理科,烏魯木齊 830054;2.蘭州軍區烏魯木齊總醫院臨床醫學研究所 830000)

目的探討不同類型淋巴瘤患者腫瘤壞死因子-β(TNF-β)在腫瘤組織與血漿中表達及其臨床意義?方法 收集97例不同類型淋巴瘤患者石蠟組織和血漿標本,應用免疫組化和ELISA法觀察組織與血漿中TNF-β表達情況?結果TNF-β在霍奇金淋巴瘤(HL)?彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)?漿細胞腫瘤(PCN)?小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞白血病(SLL/CLL)?濾泡性淋巴瘤(FL)?周圍T細胞淋巴瘤(PTL)表達較高,而在淋巴母細胞淋巴瘤(LBL)?結外NK/T細胞淋巴瘤(NK/TCL)表達較低,各種類型淋巴瘤組織TNF-β的表達情況比較,差異無統計學意義(P0.05)?在 HL?DLBCL?PCN?SLL/CLL?FL?PTL患者血漿中TNF-β水平高于健康對照組,差異有統計學意義(P0.05)?組織中TNF-β表達在國際預后指標(IPI)評分的中?高危組與低危組比較,差異有統計學意義(P0.05)?TNF-β在組織與血漿中的表達無相關性(rs=0.12,P0.05)?結論TNF-β在淋巴瘤組織與血漿中都有不同程度表達,提示TNF-β在淋巴瘤發生?發展中起到一定作用,但是TNF-β與淋巴瘤的關系比較復雜,不同的類型可能存在不同的機制?

淋巴瘤;腫瘤壞死因子類;組織;血漿

淋巴瘤是淋巴結或結外淋巴組織起源的惡性腫瘤,其組織學類型多樣,形態復雜多變,具有高度的異質性?盡管目前有部分類型淋巴瘤對化療有效,但仍有一部分治療效果差,預后不佳?腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子,淋巴細胞經抗原或有絲分裂原致敏而產生的具有腫瘤殺傷及免疫調節功能淋巴毒素α(lymphotoxin-α)命名為TNF-β?近年來發現淋巴瘤患者血清中TNF-α?TNF-β水平升高,且高水平的TNF-α與淋巴瘤的不良預后有關[1]?對于TNF-β是否有類似的作用,未見文獻報道?本實驗檢測TNF-β在新疆地區不同類型淋巴瘤患者中表達情況,探討其在淋巴瘤發生?發展過程中的作用機制,為淋巴瘤的臨床診斷?治療和預后判斷提供理論依據?

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集新疆醫科大學第一附屬醫院病理科2005年1月至2010年12月確診為淋巴瘤的石蠟組織標本97例?淋巴結反應性增生石蠟組織標本5例?所有淋巴瘤病例均做 免 疫 組 化 CD3?CD5?CD10?CD20?CD23?CD30?CD38?CD45RO?CD79α?BCL-2?BCL-6?MUM-1檢測?根據 WHO2008標準重新診斷進行分類再納入收集范圍內[2],其中霍奇金淋巴瘤(HL)12例,彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)30例,漿細胞腫瘤(PCN)20例,小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞白血病(SLL/CLL)13例,淋巴母細胞淋巴瘤(LBL)8例,濾泡性淋巴瘤(FL)3例,黏膜相關淋巴組織邊緣區B細胞淋巴瘤(MATL)2例,套細胞性淋巴瘤(MCL)2例,周圍T細胞淋巴瘤(PTL)4例,結外 NK/T細胞淋巴瘤(NK/TCL)3例?

1.1.2 血液標本 收集新疆醫科大學第一附屬醫院血液科2005年1月至2010年12月經上述石蠟組織標本確診為淋巴瘤患者的血液標本97例,其中,男54例,女43例;漢族63例,少數民族34例(維吾爾族28例,哈薩克族6例);年齡13～83歲,平均(52.44±15.33)歲?健康對照組血液標本85例,為健康體檢者,其中男51例,女34例;漢族58例,少數民族27例(維吾爾族23例,哈薩克族4例);年齡15～50歲?取空腹靜脈血2mL,EDTA抗凝,離心分離血漿,-20℃保存備用?

1.1.3 分類方法 按照Ann Arbor進行臨床分期(Ⅰ?Ⅱ?Ⅲ?Ⅳ期);根據國際預后指標(international prognosis index,IPI)分為低危組(0～1分)?中危組(2～3分)?高危組(4～5分);根據是否有B癥狀分為A組(無B癥狀)?B組(有B癥狀);根據醫院全自動生化分析儀所測得乳酸脫氫酶(LDH)300U/L為正常;C反應蛋白水平小于或等于10mg/L為正常;β2微球蛋白水平小于或等于3mg/L為正常;部分病例資料不全,在分析中去除?

1.1.4 試劑 Super Vision兩步法免疫組化試劑盒?TNF-β多克隆抗體購于武漢博士德生物工程公司;血漿TNF-β測定ELISA試劑盒購于上海藍基生物科技有限公司?

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 組織標本經10%中性甲醛溶液固定,常規脫水,石蠟包埋,4μm厚切片,切片常規脫蠟水化;3%H2O2滅活內源性過氧化物酶,枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)進行抗原熱修復,TNF-β一抗(工作液按1∶30稀釋)在4℃冰箱過夜,DAB顯色,蘇木素復染?以乳腺癌組織作為陽性對照,PBS代替一抗作為陰性對照?

1.2.2 ELISA 應用人TNF-βELISA試劑盒,以雙抗體夾心ELISA法檢測血漿TNF-β的含量?主要步驟:室溫下(20～25℃)在空白微孔中加入50μL標準品溶液,再加入50μL樣品,空白對照中加入50μL蒸餾水?除空白對照孔外,在各孔中加入100μL酶標記溶液,37℃孵育1h,充分清洗酶標板4次;然后在各孔中加入顯色劑A?B液各50μL,避光反應10 min,各孔中加入50μL終止液,混勻后用上海安泰model AT-858型自動酶標分析儀檢測450nm處吸光度值繪制TNF-β標準曲線,從中求得TNF-β含量(單位pg/mL)?

1.3 結果判定標準

1.3.1 免疫組化結果判定標準 TNF-β陽性產物主要定位于細胞質,部分細胞膜也有著色?以腫瘤細胞質中出現淡黃至棕黃色顆粒為陽性細胞,根據腫瘤細胞中陽性細胞所占的百分比分計分:≤10%為0分,>10%～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分;根據陽性細胞的著色強度計分:無色為0分,淡黃為1分,黃色為2分,棕黃色為3分?兩積分相乘,0分為陰性(-),>0～4分為弱陽性(+),>4～8分為中等陽性(++),>8～12分為強陽性(+++)[3];弱陽性及以上為陽性表達?

1.3.2 ELISA法檢測結果判定標準 為了比較免疫組化與ELISA結果是否有相關性,將 TNF-β含量進行數值轉換?TNF-β含量值經SPSS軟件分析,可測得P25=113.25pg/mL,中位數(M)=190.01pg/mL,P75=290.44pg/mL?根據以上值將計量資料變換成半定量資料:TNF-β的含量小于113.25pg/mL為陰性(-),113.25～190.01pg/mL為弱陽性(+),190.02～290.44pg/mL為陽性(++),>290.44pg/mL為強陽性(+++)[3]?

1.4 統計學處理

用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理,計量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗,計數資料采用χ2檢驗,等級資料采用Spearman相關性檢驗,檢驗水準α=0.05,以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 不同類型淋巴瘤組織中TNF-β表達 在不同類型淋巴瘤組織中TNF-β陽性表達主要為腫瘤細胞?HL組織中陽性細胞主要為R-S細胞,但多為弱陽性表達,見封2圖1?在非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中,除MALT和MCL病例較少,且TNF-β為陰性表達外,其余各型均有不同程度的表達?TNF-β在DLBCL?PCN?SLL/CLL?FL?PTL中表達較高,見封2圖2?3;而在LBL和NK/TCL中表達較低?在各種淋巴瘤組織中TNF-β表達陽性率比較,差異無統計學意義(P0.05),見表1?TNF-β在HL和NHL組織中的血管內皮細胞及吞噬細胞也有不同程度表達?在反應性增生淋巴結濾泡生發中心細胞(中心細胞和中心母細胞)?副皮質區的免疫母細胞?毛細血管內皮細胞TNF-β呈弱陽性表達,而套區?副皮質區小淋巴細胞TNF-β呈陰性表達,見封2圖4?

表1 不同類型淋巴瘤組織中TNF-β表達

2.2 不同類型淋巴瘤患者血漿中TNF-β水平 在HL?DLBCL?PCN?SLL/CLL?FL?PTL患者血漿中 TNF-β水平高于健康對照組,差異有統計學意義(P0.05);而在 MCL?NK/TCL血漿中TNF-β水平高于健康對照組,但差異無統計學意義(P0.05);LBL?MALT患者血漿中 TNF-β水平低于健康對照組,差異無統計學意義(P0.05);各種類型淋巴瘤患者血漿TNF-β比較差異無統計學意義(P0.05),見表2?

表2 不同類型淋巴瘤患者與健康對照組血漿中TNF-β水平比較(±s,pg/mL)

表2 不同類型淋巴瘤患者與健康對照組血漿中TNF-β水平比較(±s,pg/mL)

組織類型n±s 85 179.23±44.79 HL患者 12 422.65±578.96 DLBCL患者 30 217.80±138.88 PCN患者 20 240.10±261.45 SLL/CLL患者 13 225.78±180.22 LBL患者 8 171.13±79.73 FL患者 3 881.27±844.94 MALT患者 2 178.59±24.52 MCL患者 2 197.00±230.34 NK/TCL患者 3 197.44±75.21 PTL患者健康對照組4 234.59±102.72

2.3 TNF-β在淋巴瘤患者組織和血漿中表達與臨床病理特征之間關系 組織中TNF-β表達在IPI評分的中?高危組與低危組間比較,差異有統計學意義(P0.05),其余各組之間差異無統計學意義(P0.05);臨床病理特征不同患者血漿中TNF-β水平比較,差異均無統計學意義(P0.05),見表3?

表3 TNF-β在淋巴瘤組織和血漿中表達與臨床病理特征之間關系

2.4 TNF-β在不同類型淋巴瘤患者組織與血漿中表達的相關性 經Spearman等級相關性檢驗,二者無相關性(rs=0.12,P0.05),見表4?

表4 TNF-β在不同類型淋巴瘤患者組織與血漿中表達的相關性

3 討 論

TNF屬細胞因子家族,主要成員有 TNF-α和TNF-β?TNF-β與TNF-α在基因?分子結構及生物學功能上都有許多相似之處?TNF-β具有復雜的生物學活性,廣泛參與炎癥反應?免疫系統的發育和免疫調節等[4]?國外對TNF-β基因多態性與NHL關系的研究有一些報道,但結果不盡相同[5-6]?研究表明,TNF對腫瘤的作用呈雙向性,既可殺傷腫瘤細胞,亦可促使腫瘤細胞生長和浸潤?TNF-β+252基因多態性在一定水平上決定著個體的TNF-β分泌水平[5-7]?正常情況下,TNF-β是以腫瘤細胞自分泌或間質細胞旁分泌對局部起作用,理論上應是抗腫瘤作用,但是在病理狀態下抑制了細胞內TNF-β基因的轉錄和(或)翻譯,影響了TNF-β分泌,從而降低了機體局部抗腫瘤作用?因此,有些學者認為體內TNF可能起到內源性腫瘤促進劑的作用[8]?研究發現惡性淋巴瘤患者組織和血清中TNF表達水平增加,較高水平的TNF與淋巴瘤不良預后有關[9]?

本研究發現,在HL患者組織和血漿中TNF-β表達明顯升高,R-S細胞均有不同程度表達?據參考文獻[8,10]報道HL患者TNF-βmRNA表達增加,R-S細胞能產生多種細胞因子,并能表達細胞因子受體和活化抗原?HL中TNF-β的高表達可能在其發生?發展中起著重要作用,檢測TNF-β可能有助于HL的診斷?DLBCL與PTL屬于侵襲性淋巴瘤,腫瘤細胞具有高增殖活性?低凋亡率?在DLBCL與PTL組織和血漿中TNF-β高表達與淋巴瘤不良預后有關,與參考文獻[10-11]報道一致?PCN屬于惰性淋巴瘤,腫瘤細胞分泌的TNF具有促使骨質溶解加速病程進展的作用[12],Davies等[13]發現TNF基因多態性與漿細胞骨髓瘤發病有關;本組研究中3例FL有1例為Ⅲ級,2例為Ⅱ級,TNF-β表達水平高于其他類型?Jaffy等[2]報道FL組織學分級與預后有關,也有報道稱FL患者TNF-βmRNA水平高于其他類型淋巴瘤[14],與本研究結果一致?因此,TNF-β在PCN與FL組織和血漿中高表達可能與其疾病進展及不良預后有關?

本組研究發現TNF-β在SLL/CLL組織和血漿中表達較高,該組病例中有8例伴有白血病,病程多為Ⅲ～Ⅳ期,Nagy等[15]報道TNF-β表達在SLL伴有白血病患者高于沒有白血病者,并且與其病程進展有關,與本研究結果一致?本研究中2例MCL和2例MALT淋巴瘤組織中TNF-β表達為陰性,3例NK/TCL表達較低,這3種類型的淋巴瘤盡管臨床表現不一,但是組織和血漿中TNF-β表達水平較低?可能TNF-β在這些類型淋巴瘤中起的作用較小,詳細的機制不清,也未見相關文獻報道,有待于擴大樣本含量進一步的研究?TNF-β在LBL組織與血漿中表達水平較低,本研究中8例LBL中有6例為急性白血病患者,導致機體內TNF-β分泌減少,可能與這些患者機體免疫功能低下有關;也可能在患者的血漿中存在者某些加速TNF-β滅活的機制,對于這一結果還有待于進一步的探討?本研究中5例淋巴結反應性增生濾泡生發中心細胞(含較多的中心細胞和中心母細胞)?副皮質區的免疫母細胞?毛細血管內皮細胞呈弱陽性,而套區?副皮質區小淋巴細胞呈陰性?中心細胞?中心母細胞和免疫母細胞為受到抗原刺激后的轉化細胞,是處于高增殖狀態的細胞,TNF-β參與淋巴細胞轉化過程,進一步證明TNF-β在淋巴細胞的轉化過程中起著重要的作用?

IPI評分作為預后綜合指標已廣泛用于臨床,對判斷預后,指導治療具有重要意義[16]?組織中TNF-β表達與IPI評分的中?高危組有關,差異有統計學意義(P0.05);而血漿TNF-β水平與臨床不同指標之間無關?對于這一結果作者認為可能與TNF-β具有促腫瘤和抗腫瘤的雙重作用有關?在組織中TNF-β表達以腫瘤細胞陽性為標準,自分泌TNF-β主要起促腫瘤作用,故TNF-β在組織中高表達提示預后差?而血漿中所測得的是總TNF-β水平,為腫瘤細胞自分泌和血管內皮細胞?吞噬細胞旁分泌TNF-β的總和,血漿TNF-β水平與臨床不同指標的關系是二者綜合作用結果,因此,血漿TNF-β水平對臨床判斷預后的意義不大?TNF-β在不同類型淋巴瘤組織與血漿中表達無相關性,說明TNF-β自分泌與旁分泌作用存在復雜的機制,其表達水平存在明顯的差異?

綜上所述,TNF-β在淋巴瘤組織和血漿都有不同程度表達,提示TNF-β在淋巴瘤發生?發展中起到一定作用,但是TNF-β與淋巴瘤的關系比較復雜,不同的亞型可能存在不同的機制,有必要進一步研究,探討其詳細機制?

[1] 趙洪云,鐘雪云,陳運賢.腫瘤壞死因子基因多態性與非霍奇金淋巴瘤臨床與預后相關性研究[J].中國腫瘤臨床,2010,37(1):23-28.

[2]Jaffy ES,Harris NL,Stein H,et al.World Health Organization classification of tumours pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues[M].Lyon:Iarc Press,2008:111-113.

[3] 顧霞,林漢良,邵建勇,等.不同類型淋巴瘤Survivin的表達及其意義[J].癌癥,2004,23(6):655-661.

[4] Mcdevitt H,Munson S,Ettinger R,et al.Multiple roles for tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin alpha/beta in immunity and autoimmunity[J].Arthritis Res,2002,4(3):141-152.

[5] Christine F,Skibola,Paige M,et al.Tumor necrosis factor(TNF)and lymphotoxin-α(LTA)polymorphisms and risk of Non-Hodgkin lymphoma in the InterLymph consortium[J].Am J Epidemiol,2010,171(3):267-276.

[6] Cerhan JR,Liu-Mares W,Fredericksen ZS,et al.Genetic variation in tumor necrosis factor and the nuclear factorkappaB canonical pathway and risk of non-Hodgkin′s lymphoma[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2008,17(11):3161-3169.

[7] 車坤蘭,羅程,何鳳儀.子宮內膜異位癥與腫瘤壞死因子TNFα-308G/A 和 TNFβG252A 基因多態性的關系[J].解剖學研究,2010,32(1):21-24.

[8] 趙洪云,陳運賢.腫瘤壞死因子基因多態性與血液系統惡性腫瘤[J].癌癥,2003,22(2):216-220.

[9] Saberi Hosnijeh F,Krop EJ,Scoccianti C,et al.Plasma cytokines and future risk of non-Hodgkin lymphoma(NHL):a case-control study nested in the Italian European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19(6):1577-1584.

[10]Sappino AP,Seelentag W,Pelte MF,et al.Tumor necrosis factor/cachectinand lymphotoxin gene express patients[J].Blood,1990,75(4):958-962.

[11]孟偉,顧霞,王富強.TNF-α,TNF-β在彌漫性大B細胞淋巴瘤中表達及其意義[J].新疆醫科大學學報,2010,33(4):340-346.

[12]Zdzisińska B,Bojarska-Junak A,Dmoszyńska A,et al.Abnormal cytokine production by bone marrow stromal cells of multiple myeloma patients in response to RPMI8226myeloma cells[J].Arch Immunol Ther Exp,2008,56(3):207-221.

[13]Davies FE,Rollinson SJ,Rawstron AC,et al.High-producer haplotypes of tumor necrosis factor alpha and lymphotoxin alpha are associated with an increased risk of myeloma and have an improved progression-free survival after treatment[J].J Clin Oncol,2000,18(15):2843-2851.

[14]Warzocha K,Ribeiro P,Renard N,et al.Expression of genes coding for the tumor necrosis factor and lymphotoxin ligand-receptor system in non-Hodgkin′s lymphomas[J].Cancer Immunol Immunother,2000,49(9):469-475.

[15]Nagy B,Ferrer A,Larramendy ML,et al.Lymphotoxin beta expression is high in chronic lymphocytic leukemia but low in small lymphocytic lymphoma:aquantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis[J].Haematologica,2003,88(6):654-658.

[16]Zelenetz AD,Abramson JS,Advani RH,et al.NCCN clinical practice guidelines in oncology:non-Hodgkin′s lymphomas[J].J Natl Compr Canc Netw,2010,8(3):288-334.

Expression of TNF-βin subtypes of lymphoma and its significance*

,, ,,(
1.,,,,830054,;
2.,,,830000,)

ObjectiveTo investigate the expression of tumor necrosis factorβ(TNF-β)in tissue and plasma of subtypes of lymphoma and its significance.MethodsImmunohistochemical technique and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)were respectively used to assess the expression of TNF-βin 97cases paraffin tissue and plasma samples of subtypes of lymphoma.ResultsExpressions of TNF-βwere higher in HL,DLBCL,PCN,SLL/CLL,FL and PTL then in LBL,and NK/TCL.Expressions of TNF-βin tissue of subtypes of lymphoma had not significant difference(P0.05).Expression of TNF-βin plasma of HL,DLBCL,PCN,SLL/CLL,FL and PTL were higher than control group,TNF-βin these lymphoma were significant difference(P0.05).Expressions of TNF-βin tissue had significant difference between low-risk group and middle or high risk group of international prognosis index(P0.05).Expressions of TNF-βin tissue and plasma of subtypes of lymphoma had no correlation(rs=0.12,P0.05).ConclusionTNF-βhas been found various degree expressions in tissue and plasma of lymphoma,TNF-βplay a role in the development of lymphoma,but the expression of TNF-βin subtypes of lymphoma may exist different mechanisms.

lymphoma;tumor necrosis factors;tissues;plasma

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.004

A

1671-8348(2012)18-1795-04

* 基金項目:國家自然科學基金支持項目(30860096)?△

,E-mail:guxia1373@sohu.com?

2011-03-17

2011-12-21)

?臨床研究?