高強度皮秒脈沖電場對人宮頸癌Hela細胞體外作用初探*

張 玉,熊正愛△,華媛媛,章錫明,姚陳果

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科 400010;2.重慶大學輸配電裝備及系統安全與新技術國家重點實驗室 400030)

高強度皮秒脈沖電場對人宮頸癌Hela細胞體外作用初探*

張 玉1,熊正愛1△,華媛媛1,章錫明2,姚陳果2

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科 400010;2.重慶大學輸配電裝備及系統安全與新技術國家重點實驗室 400030)

目的探討高強度皮秒脈沖電場對人宮頸癌HeLa細胞的體外損傷效應及機制?方法 固定皮秒脈沖電場脈寬800 ps?頻率3Hz?場強250kV/cm,根據處理脈沖個數不同(0?1 000?3 000和5 000個),將HeLa細胞分為對照組和不同劑量皮秒脈沖處理組,通過MTT比色法檢測皮秒脈沖對各組細胞在處理后不同時間點生長抑制的影響;Fluo-3/AM探針標記細胞,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞[Ca2+]i改變;Western blot法檢測皮秒脈沖電場作用后Bax/Bcl-2蛋白表達量的改變?結果隨著脈沖劑量的增加,細胞死亡率上升,生長受到抑制,12h時抑制率最為顯著;皮秒脈沖處理可明顯升高細胞[Ca2+]i(P0.05);隨著脈沖劑量的增加,細胞內Bax蛋白表達量由對照組的0.205±0.102增加至各處理組的0.257±0.083?0.586±0.138和0.791±0.262(P0.05);Bcl-2蛋白表達量由對照組的0.694±0.132降低至各處理組的0.591±0.145?0.364±0.105和0.262±0.092(P0.05);Bax/Bcl-2比值顯著上調(P0.05)?結論高強度皮秒脈沖電場對HeLa細胞有損傷效應,并能誘導其凋亡?

電磁場;脈沖療法;細胞凋亡;腫瘤細胞,培養的

因皮秒脈沖具有超寬帶脈沖頻譜,可以通過匹配超寬帶沖激脈沖輻射天線進行發射,并將脈沖電場聚焦于特定組織,從而為實現無創治療提供了可能[7]?且前期研究結果表明,當電場脈沖脈寬由毫秒或微秒級降低至納秒級時,其對細胞的作用靶點逐漸由細胞膜進入胞內結構[8-10]?如進一步將脈沖電場脈寬降低至皮秒級,其靶向作用于胞內結構的效應是否更加明顯?是否可以直接作用于胞內細胞器(如線粒體?內質網等),進而誘導細胞發生凋亡?基于以上物理特性及假設,本實驗對人宮頸癌HeLa細胞進行體外實驗,初步探討皮秒脈沖對腫瘤細胞的生物電學損傷效應及相關機制,為基于靶向誘導凋亡的無創治療技術提供基礎研究?

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 HeLa細胞由重慶醫科大學超聲工程研究所提供;RPMI1640培養基?新生小牛血清?PBS平衡液和胰蛋白酶購于 Hyclone公司;MTT?二甲亞砜(DMSO)?Fluo-3/AM?Bradford蛋白濃度測定試劑盒和細胞裂解液購于碧云天公司;Bax兔抗人多克隆抗體?Bcl-2兔抗人多克隆抗體和羊抗兔IgG抗血清購于北京博奧森生物技術有限公司?

表1 各組細胞在不同時間點細胞死亡率(±s,%)

表1 各組細胞在不同時間點細胞死亡率(±s,%)

a:P 0.01,與同時間點對照組比較;b:P 0.01,與同時間點低劑量組比較;c:P 0.01,與同時間點中劑量組比較;d:P0.05,與同組2?24?36?48h時比較?

組別2h 12h 24h 36h 48h對照組 1.03±0.98 2.53±1.42 4.36±2.34 5.52±3.45 6.05±2.56低劑量組 35.95±1.16a 61.18±1.54ad 63.24±1.62a 62.77±0.94a 61.81±1.23a中劑量組 47.18±1.03ab 74.76±1.13abd 74.54±1.13ab 74.24±1.24ab 74.88±3.77ab高劑量組 58.35±1.18abc 86.35±1.53abcd 85.76±1.67abc 85.87±1.69abc 85.24±1.68abc

1.2 主要儀器 高強度皮秒脈沖發生器?電極小室由重慶大學輸配電裝備及系統安全與新技術國家重點實驗室研制;酶標儀為美國BIO-RAD公司產品;激光掃描共聚焦顯微鏡為德國Leica TCS-SP2公司產品?

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 復蘇細胞,將細胞置于含10%新生小牛血清的RPMI1640培養基,37℃?5%CO2培養箱內培養,2～3d傳代1次?

1.3.2 高強度皮秒脈沖電場處理 取對數生長期細胞,0.25%胰蛋白酶消化后離心,PBS液洗滌2～3次,校正細胞密度至2×106個/毫升備用?固定場強250kV/cm?重復頻率3Hz?脈寬800ps,按照脈沖個數的不同(0?1 000?3 000和5 000個)分為對照組及低?中?高劑量組?每組取500μL細胞懸液置于電極小室,給予相應劑量電脈沖,對照組不予電處理?

1.3.3 MTT檢測細胞死亡率 收集各組細胞,每組每孔吸取20μL細胞懸液接種于96孔板,調零組僅加入培養液而不加細胞懸液,每組設5個復孔,共接種5塊培養板,于37℃?5%CO2培養箱內培養2?12?24?36?48h,平板離心機2 000r/min離心5min?每孔加入MTT溶液20μL,避光培養4h,棄上清液,每孔加DMSO 150μL,振蕩15min,測定吸光值(A570)?根據公式:細胞死亡率(%)=(對照組A570-實驗組A570)/(對照組A570-調零組A570)×100%,計算出每組細胞死亡率的平均值?以上實驗重復3次?

1.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測細胞[Ca2+]i改變 細胞處理及分組同前?將8mm×8mm蓋玻片置于24孔板中,每孔加入RPMI1640培養液500μL,取各組細胞各1×106個種植于蓋玻片上,每組設3個復孔?由MTT結果可知細胞在12h死亡率達到高峰,因此于37℃?5%CO2培養箱培養12h?吸去培養液,用無血清培養液洗滌2次,加入5μmol/L Fluo-3/AM 熒光探針,37℃避光孵育60min?PBS洗滌3次?滴加10μL 50%甘油于載玻片上,勾取蓋玻片,將爬有細胞的一面接觸甘油蓋于載玻片上完成封片?用倒置熒光顯微鏡物鏡觀察,激發波長488nm,發射波長530nm,按照XYZ三維掃描,掃描密度為1 024×1 024采集熒光圖像?每組隨機選取8個單細胞,用LSCM定量分析軟件測出各細胞相對熒光強度,取平均值?

1.3.5 Western blot法檢測 Bax?Bcl-2蛋白表達 細胞處理及分組同前?收集處理后孵育12h的各組細胞,PBS重懸并計數,取1×106個細胞離心沉淀,用已加PMSF的細胞裂解液200μL冰浴裂解1h,4℃12 000×g,離心10min,收集上清液,用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,以40μg蛋白質標本上樣,經12%十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質,電轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1h,加入Bcl-2?Bax一抗4℃過夜,TBST室溫洗3次,每次10min,加入二抗常溫孵育1h,TBST室溫洗3次,每次10min,凝膠成像系統顯色,檢測激活型Bcl-2?Bax蛋白水平,以β-actin水平作為等量蛋白上樣對照?用Quantity One圖像分析軟件分析結果,印跡條帶吸光度=平均吸光度×面積?Bax/Bcl-2=Bax條帶吸光度/Bcl-2條帶吸光度?

橫在李愫和蕭之間的同樣還有文化而差異，李愫生長在嘉義農村，五個哥哥目不識丁，而當初李愫考上大學時家人認為當老師對于這個農民家庭是件光宗耀祖的事情，所以受到了全票支持。李愫的丈夫蕭出生優渥，他崇拜美國文化，幾十年來一直模仿者美國的生活方式，他要求李愫打扮成他想要的樣子，而李愫十多年來究竟還是沒有學會蕭的那套美國的生活方式，蕭曾經甚至稱李愫為“農業社會”的產品，這種自以為是的優越使得李愫很不是滋味，李愫“一寸一寸的發覺，嫁給一個人，也同時嫁給對方的社會”③，這就像一個代表了傳統一個代表了現代，一個是東方一個是西方，這不僅僅是夫妻雙方在生活上的矛盾，更是兩種文化在一場婚姻中的沖撞。

1.4 統計學處理 所有實驗進行至少3次?使用SPSS18.0統計分析軟件進行統計學處理,數據均用±s表示,MTT結果進行重復測量數據的方差分析,激光掃描共聚焦及Western blot檢測采用AVOVA檢驗?以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 各組細胞死亡率 脈沖處理后2?12?24?36?48h各組細胞的死亡率見表1?相同時間點,處理脈沖個數越多,細胞的死亡率越高,存在明顯的劑量依賴關系;同一處理組細胞,于處理后12h細胞死亡率達到高峰,明顯高于其余各時間點(P0.01)?

圖1 LSCM透射掃描Hela細胞檢測皮秒脈沖對[Ca2+]i的影響(×200)

2.2 各組細胞[Ca2+]i檢測結果 HeLa細胞經 Fluo-3/AM裝載后細胞質呈綠色熒光?低?中?高劑量組掃描視野內可見細胞質內熒光,與對照組相比普遍增強,個別細胞熒光極度增強;對照組細胞普遍為弱熒光強度,見圖1?各組隨機采集8個結構清晰?胞膜完整的單HeLa細胞,測定其熒光強度并行半定量分析,低?中?高劑量組細胞相對熒光強度分別為58.40±4.80?75.89±8.93和101.72±9.62,均明顯高于對照組(39.14±5.97,P0.01)?

2.3 Bax?Bcl-2蛋白表達結果 對照組中Bax表達量較低,經皮秒脈沖處理后,其表達量升高,且脈沖劑量越大,表達越強;抗凋亡蛋白Bcl-2在各處理組表達較對照組有所減弱(P0.01);Bax/Bcl-2比例上調,促凋亡作用明顯,且高劑量組Bax/Bcl-2比例上調現象最為明顯,其誘導凋亡的作用最強,見圖2?3?

圖2 Western blot法檢測Bax?Bcl-2表達的結果

圖3 各組細胞Bax/Bcl-2平均光密度值

3 討 論

宮頸癌的發病率居女性生殖系統惡性腫瘤之首,目前主要采取手術結合放?化療的綜合治療方案?傳統治療在治病的同時往往會對生殖器官造成嚴重損害,影響性功能及生育能力?隨著近年來宮頸癌發病年輕化及患者對生活質量要求的不斷提高[11],尋求一種既能有效殺滅腫瘤細胞又能保持生殖系統完整性的無創治療手段,是醫患雙方的共同期待?高強度皮秒脈沖電場因其高場強?低脈寬的物理學特性,具有集中性好?激發能量高?超寬帶頻譜豐富?方向性精確?控制性良好等優勢,成為無創治療研究的良好選擇?

目前,國內外有關高強度皮秒脈沖生物電效應機制的研究甚少,僅有兩篇有關皮秒脈沖實驗研究的報道,證實了皮秒脈沖對腫瘤細胞的損傷效應是熱效應和電效應的聯合作用,但并未進行相關機制探討[12]?與上述研究不同,本研究一方面通過降低皮秒脈沖參數劑量以避免熱效應,同時進行相關機制探討,用不同實驗方法探討皮秒脈沖電場對HeLa細胞的損傷效應及相關機制?

MTT比色法顯示經高強度皮秒脈沖作用后HeLa細胞生長受到不同程度抑制,且存在明顯的劑量和時間依賴關系?已知細胞死亡可表現為壞死和凋亡,其中壞死即刻發生,而凋亡需要時間來完成?因此,處理后2h細胞生長抑制可能由細胞壞死造成,而處理后12h細胞抑制率增高,則說明細胞可能發生了凋亡?為了研究高強度皮秒脈沖能否誘導細胞凋亡,本研究同時進行了細胞[Ca2+]i和 Bax/Bcl-2蛋白表達量實驗檢測?

激光掃描共聚焦示皮秒脈沖處理組細胞熒光強度顯著高于對照組,提示皮秒脈沖可導致細胞[Ca2+]i升高?已知哺乳動物細胞核膜與細胞膜的充電時間常數分別為幾十納秒(ns)和幾百納秒,而細胞器的充電時間常數僅為幾百皮秒(ps)[13]?高強度皮秒脈沖電場具有極高的場強?極窄的脈寬(ps級),當作用于細胞時,不滿足細胞膜電穿孔所需的充電時間,對細胞膜無損傷,而胞內細胞器(如線粒體?內質網等)因充電速度極快,可先于細胞膜與核膜受到影響[14],故可以排除[Ca2+]i升高是由于細胞膜不完整情況下胞外Ca2+內流所致,而可能來自于內質網?線粒體等胞內Ca2+庫的釋放?Ca2+是細胞內重要的第二信使,已有大量研究證實[Ca2+]i升高參與了凋亡早期信號轉導和凋亡的執行階段?線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩解,[Ca2+]i升高,使許多與細胞凋亡直接相關的酶或蛋白質被釋放到胞質中,就可能通過破壞核內染色質?激活Caspase或作用于其他Ca2+依賴性蛋白質引起細胞凋亡?本實驗中處理組細胞[Ca2+]i升高,很可能進而誘導細胞凋亡?

Bcl-2基因家族及其相關蛋白Bcl-2是研究最早的與凋亡有關的基因,也是目前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族?Bcl-2是細胞凋亡的負調因子,Bax能拮抗Bcl-2,進而促進細胞凋亡?因此,細胞中Bax/Bcl-2比例可以反映細胞的死亡調控狀態?本實驗中處理組細胞Bax/Bcl-2比例上調,且高劑量組最為明顯,說明高強度皮秒脈沖電場能影響細胞的生存狀態,促進細胞內Bax高表達,從而誘導細胞凋亡的發生?

高強度皮秒脈沖電場因其獨特的物理學特性,有望成為繼熱療?磁療?高強度聚焦超聲等療法之后又一種新穎?無創?有效的腫瘤物理治療手段?目前國外對皮秒脈沖電場的生物學效應研究甚少,本課題組在國內首次對皮秒脈沖電場對腫瘤細胞的生物電學效應進行研究,旨在為基于靶向誘導凋亡的高強度皮秒脈沖無創治療技術提供研究基礎,其有效實驗參數的篩選?細胞凋亡分子機制的探討?動物實驗中皮秒天線的輻射及聚焦等諸多領域有待進一步研究解決?

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In vitro study of damaging effects of intense picosecond pulsed electric field on HeLa cells*

, ,,,
(1.,,,400010,;2.,,400030,)

ObjectiveTo investigate the damaging effect and mechanism of intense picosecond pulsed electric field(psPEF)on HeLa cells in vitro.MethodsIntense psPEF with constant parameters(pulse duration of 800ps,repetition frequency of 3Hz,and electric intensity of 250kV/cm)and different pulses(0,1 000,3 000and 5 000)were performed on HeLa cells.MTT assay was used to trace the effect of growth inhibition at different times.The changes of[Ca2+]i in HeLa cells were observed by laser scanning confocal microscope using Fluo-3/AM as the calcium fluorescent indicator.Western blot was used to measure the changes of expression level of Bcl-2and Bax.ResultsThe mortality rate of HeLa cells elevated with increasing of the amount of pulses,and the maximum inhibitory rate was observed 12hafter the treatment.Compare with the control group,[Ca2+]i was markedly increased by treatment with psPEF (P0.05).By increasing the pulse number,the expression of Bax was increased from 0.205±0.102in control group to 0.257±0.083,0.586±0.138and 0.791±0.262in treated groups(P0.05),and Bcl-2was decreased from 0.694±0.132in control group to 0.591±0.145,0.364±0.105and 0.262±0.092in treated groups(P0.05),demonstrating significant increase of Bax/Bcl-2ratio in all treated groups(P0.05).ConclusionIntense psPEF can damage the HeLa cells as well as inducing tumor cell apoptosis.

electromagnetic fields;pulse therapy;apoptosis;tumor cells,cultured

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.001

A

1671-8348(2012)18-1785-03

* 基金項目:國家自然科學基金面上項目(81172123,50877083)?△

,Tel:13908359484;E-mail:xiongzhengai61@21cn.com?

2011-12-19

2012-02-22)

?論 著?