血紅素氧合酶-1在姜黃素抑制氧化型低密度脂蛋白誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用

鐘 毅,賴文巖,劉挺榕,郭志剛

(南方醫科大學南方醫院心內科,廣州 510515)

血紅素氧合酶-1在姜黃素抑制氧化型低密度脂蛋白誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用

鐘 毅,賴文巖,劉挺榕,郭志剛△

(南方醫科大學南方醫院心內科,廣州 510515)

目的觀察姜黃素對氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導的大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響,并探討血紅素氧合酶-1(HO-1)在姜黃素抑制血管平滑肌細胞增殖中的作用及機制?方法 體外分離培養大鼠血管平滑肌細胞并行免疫組化鑒定,以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞增殖率?逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測HO-1mRNA水平,蛋白免疫印跡法(Western blot)分別檢測HO-1及增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達水平?結果Ox-LDL呈濃度依賴性(0～150μg/mL)地誘導VSMC增殖,達到200μg/mL具有細胞毒性;姜黃素呈濃度依賴性(40?80μmol/L)地抑制 Ox-LDL(100μg/mL)所誘導的VSMC增殖,HO-1抑制劑鋅原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)可明顯減弱此抑制效應;姜黃素可誘導VSMC上調HO-1mRNA和蛋白表達;姜黃素可減弱Ox-LDL誘導VSMCs增殖細胞核抗原的高表達,此效應可被HO-1抑制劑ZnPPⅨ抑制?結論姜黃素通過降低HO-1介導的PCNA表達,進而抑制Ox-LDL誘導大鼠血管平滑肌增殖?

姜黃素;氧合酶類;脂蛋白類,LDL

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發生機制十分復雜,目前研究表明氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要病理基礎[1]?姜黃素是從姜黃?郁金?莪術等植物中提取的一種生物多酚化合物,研究顯示姜黃素具有抗炎?抗氧化?促細胞凋亡和抑制細胞增殖等藥理作用,這些作用可有效拮抗AS的發生與發展?血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶,發揮著抗炎?抗氧化?抑制細胞凋亡和改善組織微循環作用,動物研究已經證明過表達HO-1可以明顯延緩AS進展[2],但是姜黃素抗AS的相關機制還不甚清楚?本研究旨在于細胞水平探討姜黃素對Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖的影響及其相關機制,為其藥理作用提供理論基礎?

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基?胎牛血清?胰蛋白酶購自美國Gibico公司;姜黃素?鋅原卟啉Ⅸ(zine protoporphyrinⅨ,Zn-PPⅨ)購自Sigma公司;Ox-LDL購于北京普博斯生物科技有限公司;反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑均購自美國Invitrogen公司;一抗?二抗均購于美國Santa Cruz公司;SD大鼠購自南方醫科大學實驗動物中心;其余實驗相關產品購自碧云天生物技術公司?

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與實驗分組按常規組織貼塊方法[3]原代培養并傳代,取用第3～8代細胞?免疫組化法鑒定血管平滑肌細胞?血管平滑肌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃?5%CO2下培養?實驗分組:(1)正常對照組:不加任何處理;(2)不同終濃度 Ox-LDL刺激組(0?50?100?150?200?250μg/mL);(3)不同終濃度姜黃素組(0?20?40?80μmol/L);(4)不同終濃度姜黃素組(0?20?40?80μmol/L)+Ox-LDL(100μg/mL)組;(5)Ox-LDL(100μg/mL)+姜黃素組;(6)姜黃素+ZnPPⅨ+Ox-LDL(100μg/mL)組?

1.2.2 反轉錄-聚合酶鏈反應檢測 HO-1mRNA 按 Trizol試劑盒說明提取總RNA?取細胞RNA 1μL根據試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA,進行PCR擴增?HO-1:上游5′GGGTGACAGAAGAGGCTAAGACC 3′,下 游 5′ AGATTCTCCCCTGCAGAG AGAAG 3′?擴增條件:94℃ 變性30s,56℃退火30s,72℃ 延伸45s,循環30次?電泳條帶采用凝膠成像系統分析?

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比色測定VSMC增殖率 VSMC接種96孔培養板中(每孔1×104個細胞)孵育24h,換無血清DMEM培養基24h后棄培養液,按實驗分組加入藥物?20h后加入5mg/mL MTT 10μL,孵育4h,終止反應?棄孔內培養液上清液加二甲基亞砜100μL,選擇492nm自動酶標光度計測定各孔吸光度值?細胞增殖率計算公式:細胞增殖率(cell viability)= 處理孔A492/對照孔 A492×100%?

1.2.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 HO-1及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表達水平 收集細胞并加入細胞裂解液裂解細胞,離心收集上清液,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測蛋白濃度?蛋白(30μg)經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDSPAGE)分離后轉移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜?5%牛血清清蛋白室溫封閉4h,加入一抗4℃過夜?二抗室溫孵育2h,最后顯像?

1.3 統計學處理 數據均采用±s表示,采用單因素方差分析,總體有差異兩兩比較采用最小顯著差數法?采用SPSS13.0軟件進行分析,P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 大鼠血管平滑肌細胞鑒定 培養的第3代細胞經免疫細胞化學檢測,特異性的α-actin在免疫細胞化學染色后,胞漿著色,呈陽性反應,在鏡下可見胞漿內大量棕色?與細胞長軸平行的纖維細絲,即平滑肌α肌動蛋白,見封3圖1?

2.2 Ox-LDL對誘導大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響 Ox-LDL呈濃度依賴性(0～150μg/mL)地誘導 VSMC增殖,但是當達到200μg/mL刺激組時,細胞數目減少,提示到達此濃度可能具備細胞毒性?各個濃度刺激組與空白對照組相比,細胞增殖顯著,差異具有統計學意義(P0.05),見圖2?

2.3 姜黃素對Ox-LDL刺激的VSMCs增殖的影響 不同終濃度的姜黃素(40?80μmol/L)可明顯抑制 Ox-LDL(100μg/mL)誘導的細胞增殖效應,且呈濃度依賴性;姜黃素(40?80 μmol/L)+Ox-LDL組與 Ox-LDL單獨作用組相比,細胞增殖率顯著降低,差異具有統計學意義(P0.05),見圖3?

圖2 Ox-LDL對誘導大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響

2.4 HO-1抑制劑ZnPPⅨ對姜黃素抑制Ox-LDL所誘導的VSMC增殖的影響 給予HO-1抑制劑ZnPPⅨ預處理細胞后,姜黃素抑制Ox-LDL所誘導的VSMCs增殖效應減弱;姜黃素+ZnPPⅨ+Ox-LDL組與姜黃素+Ox-LDL組相比,細胞增殖率增加明顯(P0.05),見圖4?

2.5 姜黃素對VSMC的HO-1表達的影響 不同濃度姜黃素組干預VSMC的HO-1mRNA和蛋白表達水平明顯高于空白對照組,實驗重復3次,見封4圖5?

2.6 姜黃素對Ox-LDL刺激VSMC的PCNA表達的影響

相比較于空白對照組,Ox-LDL可明顯增強PCNA的表達;而姜黃素+Ox-LDL組與Ox-LDL組單獨作用比較,可明顯抑制PCNA的表達;在加入HO-1抑制劑ZnPPⅨ后,姜黃素+Ox-LDL組的抑制PCNA表達效應可被減弱,實驗重復3次,見封4圖6?

圖3 姜黃素對 Ox-LDL(100μg/mL)所誘導的VSMC增殖的影響

圖4 ZnPPⅨ對姜黃素抑制Ox-LDL所誘導的VSMCs增殖的影響

3 討 論

平滑肌細胞增殖是AS斑塊形成過程中的重要環節,大量研究表明動脈血管壁增厚至斑塊形成是AS病變的主要病理特征?Ox-LDL促進AS形成的作用已被大量的研究所證實?目前認為AS形成初期步驟是LDL進入內皮損傷部位的血管壁,氧化?誘導多種趨化因子,并激活單核細胞分泌不同的生長因子和細胞因子,刺激平滑肌細胞遷移?增殖?因此,Ox-LDL在AS中起到關鍵作用?

HO-1是血紅素降解的起始酶和限速酶,HO-1通過降解血紅素產生一氧化碳(carbon monoxide,CO)?膽綠素和鐵離子?膽綠素進一步經膽綠素還原酶作用生成膽紅素,而鐵離子能誘導鐵蛋白的合成[4]?HO-1的這些終產物具有抗炎?抗氧化?抗凋亡和抗血栓的作用;另外,CO和膽色素通過影響血管平滑肌細胞?內皮細胞?內皮祖細胞和粒細胞的增殖?遷移和黏附保護受損動脈血管內平衡[5]?姜黃素是中藥姜黃的主要成分,其抗炎?抗氧化?抗腫瘤?抗血栓以及心血管的保護作用已經被證實[6]?目前已經有研究表明姜黃素具有抗細胞增殖的作用,但是具體機制還不甚清楚[7-8]?根據其眾多藥理作用與HO-1保護作用相似,姜黃素的相關保護作用是否經過HO-1介導值得研究?

本研究結果顯示,Ox-LDL在一定濃度范圍內濃度依賴性地誘導血管平滑肌細胞增殖,當超過一定濃度,具備細胞毒性?此實驗發現與Chang等[9]的研究結果相類似,說明了Ox-LDL對血管平滑肌細胞增殖影響的特點,其機制可能是通過激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路促進細胞有絲分裂[10]?與之類似,Schwer等[11]也發現姜黃素 HO-1介導抑制胰腺星狀細胞的增殖由阻遏ERK1/2磷酸化的機制實現?同時,本組也發現姜黃素可有效抑制Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖,并且此抑制效應可被HO-1的抑制劑ZnPPⅨ部分阻斷?這提示HO-1很可能參與了姜黃素抑制Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖的保護效應?同樣,有學者發現在球囊損傷的大鼠模型中,HO-1介導NO抑制大鼠血管平滑肌增殖,從而顯著地抑制了內膜增生[12]?為了進一步證實此發現,本組觀察了姜黃素對血管平滑肌細胞HO-1mRNA和蛋白表達的影響,發現姜黃素可顯著地上調血管平滑肌細胞HO-1mRNA和蛋白表達?綜上所得出的實驗結果,提示姜黃素抗Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖的作用經過HO-1介導?

PCNA又稱周期蛋白,是一種與細胞增殖周期有關的核內糖蛋白,是DNA復制的必需成分,其表達與細胞增殖活性有關,是使細胞由靜息期進入S期的關鍵蛋白[13],已成為評價細胞增殖狀態的一項客觀指標?本組研究發現HO-1抑制劑上調姜黃素抑制Ox-LDL誘導VSMCs增殖細胞核抗原高表達,提示HO-1介導的抑制增殖的效應可能部分通過抑制PCNA表達實現?另外研究發現HO-1的抗增殖效應通過上調細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子P21[14],P21是細胞周期素蛋白cdk-2抑制蛋白,cdk-2亦是細胞周期G1和S期調節關鍵?Liu等[15]以含HO-1基因的重組腺病毒轉染大鼠主動脈平滑肌細胞,被轉染的大鼠主動脈平滑肌細胞以劑量依賴方式表達HO-1mRNA?HO-1蛋白和提高酶的活性,刺激促凋亡基因p53表達,促進VSMCs凋亡而抑制血清刺激的VSMCs增殖?

綜上所述,姜黃素顯著地抑制Ox-LDL誘導的大鼠VSMC增殖,其機制是由HO-1介導的PCNA表達下調實現的?這為進一步研究姜黃素防治AS提供了一定的理論依據?

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Role of heme oxygenase-1 on curcumin inhibiting rat vascular smooth muscle cells proliferation induced by oxidized low density lipoprotein

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(,,,,510515,)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of curcumin on oxidized(Ox)-low density lipoprotein(LDL)-induced rat vascular smooth muscle cells proliferation and to explore the role of heme oxygenase-1in this process.MethodsThe cultured aortic smooth muscle cells isolated from male Sprague-Dawley rats were verified by immunohistochemistry.The cell viability was assayed by MTT,and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was performed to determine the level of HO-1mRNA.In addition,HO-1and PCNA expression were analyzed by Western blotting.ResultsThe Ox-LDL remarkably stimulated VSMCs proliferation in a concentration-dependent manner(0-150μg/ml),however,the doses that exceeded 200mg/ml had a cytotoxic effect.Curcumin also attenuated the VSMCs proliferation effect of Ox-LDL in a concentration-dependent manner(40,80μM),the inhibitory effect was blocked by a HO-1inhibitor(zine protoporphyrinⅨ,ZnPPⅨ).Curcumin significantly upregulated HO-1mRNA and protein expression in a concentration-dependent manner.Furthermore,ZnPPⅨblocked the inhibitory effect of curcumin on Ox-LDL-induced PCNA expression.ConclusionCurcumin inhibits Ox-LDL-induced rat vascular smooth muscle cells proliferation via HO-1-mediated down-regulation of PCNA expression.

curcumin;oxygenases;lipoproteins,LDL

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.018

A

1671-8348(2012)16-1609-03

△ 通訊作者,Tel:(020)61641508;E-mail:guozhigang126@126.com?

2011-09-11

2011-12-22)

?基礎研究?